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Dec 30, 2023

Ein mikrofluidisches Diagnosegerät mit Luftstopfen

Wissenschaftliche Berichte Band 12,

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 12852 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Identifizierung versehentlicher Allergenkontaminationen in verarbeiteten Lebensmitteln ist für Risikomanagementstrategien in der Lebensmittelindustrie von entscheidender Bedeutung, um Vorfälle von Lebensmittelallergien wirksam zu verhindern. Hier schlagen wir ein neu entwickeltes passives Absperrventil mit hoher Druckbeständigkeit vor, das als „Luftsteckventil“ bezeichnet wird, um mikrofluidische Geräte für den Nachweis von Zielnukleinsäuren weiter zu verbessern. Durch die Implementierung des Luftsteckventils als permanentes Absperrventil konnte eine maximal zulässige Durchflussrate von 70 µL/min für die sequentielle Flüssigkeitsabgabe in eine Anordnung von 10 Mikrokammern erreicht werden, was 14-mal höher ist als mit dem vorherigen Ventil Anordnung mit einseitigen Absperrventilen. Darüber hinaus demonstrieren wir den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Lebensmittelallergene (Weizen, Buchweizen und Erdnuss) basierend auf dem kolorimetrischen Schleifen-vermittelten isothermen Amplifikationsassay unter Verwendung unseres Diagnosegeräts mit 10 Mikrokammern, die kompakt in einem Kreis mit 20 mm Durchmesser angeordnet sind. Nachdem die Tests 60 Minuten lang bei 60 °C durchgeführt wurden, lieferte jede Kombination der drei Arten von Lebensmittelallergenen und Teepflanzen, die als positive bzw. negative Kontrollproben verwendet wurden, korrekte Testergebnisse, ohne dass es zu einer Kreuzkontamination zwischen den Mikrokammern kam . Somit bietet unser Diagnosegerät eine schnelle und einfache Proben-zu-Antwort-Plattform zur Gewährleistung der Lebensmittelsicherheit.

Nahrungsmittelallergien sind immunvermittelte Nebenwirkungen, die durch das Einatmen oder die Einnahme von Proteinen in bestimmten Nahrungsmitteln ausgelöst werden1,2,3. Die Inzidenz- und Prävalenzraten von Nahrungsmittelallergien haben in den letzten Jahrzehnten zugenommen und stellen ein globales Gesundheitsproblem dar. Allergene können nicht nur akute allergische Reaktionen wie Haut (Nesselsucht), Atemwege (Keuchen, Husten) und Magen-Darm-Trakt (Übelkeit, Erbrechen und Durchfall) verursachen, sondern auch kritische Zustände wie Anaphylaxie4,5. Derzeit ist die Kennzeichnung von Lebensmittelallergenen in vielen Ländern obligatorisch und gesetzlich vorgeschrieben. In Japan wurden Vorschriften zur Kennzeichnung von Lebensmittelallergenen für verarbeitete Lebensmittel erlassen, die sieben spezifische Rohstoffe enthalten, darunter Weizen, Buchweizen, Erdnüsse, Eier, Milch, Garnelen und Krabben. Die Richtlinien schreiben vor, dass alle Lebensmittel, die allergene Proteine ​​enthalten, gekennzeichnet werden müssen, wenn die Konzentration 10 mg/kg (ppm) übersteigt6. Bei Verbrauchern, die unter einer Lebensmittelallergie leiden, kann bereits eine geringe Menge eines Allergens eine allergische Reaktion auslösen7. Daher ist die schnelle und einfache Identifizierung verarbeiteter Lebensmittel, die versehentlich mit allergenen Substanzen kontaminiert sind, von entscheidender Bedeutung für Risikomanagementstrategien in der Lebensmittelverarbeitungsindustrie, um Vorfälle von Lebensmittelallergien wirksam zu verhindern.

Viele Methoden zum Nachweis verschiedener Nahrungsmittelallergene wurden bewertet8. Der Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) wird aufgrund seiner Vorteile wie hoher Empfindlichkeit, hoher Spezifität, einfacher Anwendung und hohem Probendurchsatz häufig für die quantitative Analyse von Zielproteinen eingesetzt. Dementsprechend ist es einer der am häufigsten verwendeten Tests zum Nachweis und zur Quantifizierung von Lebensmittelallergenen in der Lebensmittelindustrie und in offiziellen Lebensmittelkontrollbehörden9,10. Für den Nachweis von Lebensmittelallergenen sind mehrere ELISA-basierte immundiagnostische Testkits im Handel erhältlich11,12,13. Proteine ​​sind jedoch anfällig für einen unbeabsichtigten proteolytischen Abbau während der Extraktionsprozesse, die in proteinbasierten Nachweismethoden verwendet werden, was zu falsch-negativen Ergebnissen führen kann, und komplexe Lebensmittelmatrizes können störende organische Komponenten enthalten, die zu falsch-positiven Ergebnissen führen können14,15. Da DNA-Moleküle stabiler sind als Proteine, werden zunehmend Nukleinsäure-basierte Nachweismethoden eingesetzt, unter denen die quantitative Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (qPCR) die am weitesten verbreitete Methode zur Amplifikation spezifischer Nukleinsäure-Ziele (DNA/RNA) ist beim Nachweis von Lebensmittelallergenen16,17,18,19. Allerdings erfordern qPCR-Tests hochqualifiziertes Personal und teure Ausrüstung (z. B. einen Thermocycler) mit präziser Temperatursollwertsteuerung für die Amplifikation und sind daher kein kostengünstiges und einfach zu verwendendes Nachweiswerkzeug.

Die schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (LAMP) wurde als Alternative zur qPCR für den Vor-Ort-Nachweis erkannt, ohne dass spezielle Geräte erforderlich sind20,21. Der LAMP-Assay, bei dem ein Satz von vier bis sechs speziell entwickelten LAMP-Primern und Bst-DNA-Polymerase mit hoher Strangverdrängungsaktivität zur Amplifikation eines spezifischen DNA-Ziels verwendet werden, kann in 30–60 Minuten unter isothermen Bedingungen (60–65 °C) durchgeführt werden °C)22,23. Es stehen verschiedene Methoden zum Nachweis von LAMP-Amplifikationsprodukten zur Verfügung, wie z. B. die Visualisierung der Amplifikationsprodukte durch herkömmliche Gelelektrophorese nach der Amplifikation, Echtzeitmessung der Trübung, die durch das als Reaktionsnebenprodukt erzeugte Magnesiumpyrophosphat verursacht wird, und Echtzeiterkennung von die LAMP-Amplikons unter Verwendung eines interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffs (z. B. SYBR Green I). Darüber hinaus ist eine kolorimetrische Detektion mit bloßem Auge mithilfe von Indikatorfarbstoffen möglich. Beispielsweise ist Phenolrot ein pH-empfindlicher Indikatorfarbstoff, der zur Überwachung signifikanter pH-Änderungen von alkalisch zu sauer im Zusammenhang mit der LAMP-Reaktion verwendet wird, und Hydroxynaphtholblau (HNB) ist ein Metallindikatorfarbstoff, der zur Überwachung eines schnellen Abfalls der Konzentration von freiem Mg2+ verwendet wird Ionen aufgrund der Bildung von unlöslichem Magnesiumpyrophosphat während der DNA-Amplifikation24,25,26. Allerdings gibt es bei der konventionellen LAMP-Methode noch grundlegende Probleme, die für ihre Anwendung in der Vor-Ort-Multiplex-Diagnostik mehrerer Lebensmittelallergene gelöst werden müssen. Das heißt, es ist notwendig, viele Proben-/Reagenzmischungen für jedes Nahrungsmittelallergen-Ziel vorzubereiten und individuell zu testen. Dieses Verfahren erfordert nicht nur eine lange und langwierige Probenvorbereitung, um ein Testergebnis zu erhalten, sondern auch eine relativ große Menge an LAMP-Reagenzien, im Allgemeinen 10–25 µL für den Test eines einzelnen Lebensmittelallergens. Um diese Bedenken auszuräumen, verfügen Lab-on-a-Chip-Technologien über ein erhebliches Potenzial, gemultiplexte LAMP-Assays in Mikrofluidikgeräten für den gleichzeitigen Nachweis gezielter Nukleinsäuren in einem einzigen Vorgang zu ermöglichen27,28,29,30,31,32,33,34 .

In unseren früheren Studien35,36,37 haben wir ein vielseitiges Mikrofluidikgerät für den Multiplex-Nachweis gezielter Nukleinsäuren basierend auf der LAMP-Methode entwickelt. Das mikrofluidische Gerät ermöglicht die sequentielle Abgabe von Proben-/Reagenzmischungen in eine Reihe von Reaktionsmikrokammern in einem einzigen Vorgang und bietet so möglicherweise eine Plattform für eine schnelle und einfache Proben-zu-Antwort-Diagnose. Mit dem Ziel, Ernteverluste zu minimieren und eine stabile Versorgung mit erschwinglichen Nahrungsmitteln in der Landwirtschaft sicherzustellen, haben wir die Fähigkeit des hergestellten Diagnosegeräts demonstriert, nicht nur ein DNA-Pflanzenvirus zu erkennen, das Tomaten infiziert, sondern gleichzeitig auch vier RNA-Pflanzenviren, die Kürbisgewächse infizieren, innerhalb von 60 Jahren 35 Minuten. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die giftige Pflanze Colchicum Autumnale innerhalb von 60 Minuten nachgewiesen werden kann, um eine zuverlässige Screening-Methode für Pflanzenvergiftungen in der medizinischen Notfallversorgung bereitzustellen36. Darüber hinaus können wir gleichzeitig die Coronavirus-Erkrankung und andere Infektionskrankheiten diagnostizieren, einschließlich solcher, die durch schweres akutes respiratorisches Syndrom, saisonale Influenza A und pandemische Influenza A 2009 verursacht werden, indem wir mit unserem Mikrofluidikgerät 30 Minuten lang einen kolorimetrischen Reverse-Transkriptions-LAMP-Assay durchführen37. Bei dem zuvor vorgeschlagenen Verfahren zur sequentiellen Flüssigkeitsabgabe ist die maximal zulässige Durchflussrate für die Abgabe mehrerer Mikrokammern jedoch durch einen Anstieg des Strömungswiderstands begrenzt, der nicht nur proportional zur Durchflussrate, sondern auch zur Anzahl der gefüllten Mikrokammern zunimmt. In dieser Studie haben wir eine neue Ventilkonfiguration entworfen, die als permanentes Absperrventil (im Folgenden als „Luftsteckventil“ bezeichnet) im mikrofluidischen Diagnosegerät verwendet werden soll, mit dem Ziel, die Leistung der sequentiellen Flüssigkeitsabgabe deutlich zu verbessern eine Reihe von Reaktionsmikrokammern. Das hervorstechendste Merkmal des hier vorgeschlagenen Luftsteckventils besteht darin, dass die Flüssigkeiten, die einen Satz aus zwei passiven Ventilen erreichen, durch den Luftstecker gegeneinander drücken, was zu einer hohen Druckwiderstandsleistung führt, da der ausgeübte Druck ausgeglichen wird. Mithilfe eines optimal konzipierten Mikrofluidikgeräts mit 10 kreisförmig angeordneten Mikrokammern demonstrieren wir den gleichzeitigen Nachweis von drei Nahrungsmittelallergenen basierend auf spezifischen DNA-Zielen von Weizen (Triticum aestivum), Buchweizen (Fagopyrum esculentum) und Erdnuss (Arachis hypogaea).

Wir haben einen Herstellungsprozess für ein auf Polydimethylsiloxan (PDMS) basierendes Mikrofluidikgerät entwickelt, das für den Multiplex-Gennachweis eingesetzt wird und einen Soft-Lithographie-Prozess und einen Wachs-Reflow-Prozess kombiniert38. Abbildung 1a zeigt ein Beispiel des hergestellten mikrofluidischen Geräts (mit einer Größe von 50 mm × 25 mm), das aus zwei Hauptteilen besteht: einem Mischbereich und einem Abgabebereich, die auch als Reaktions- und Nachweisbereiche dienen. Fünf Mikrokammern in einem Array sind über zwei unabhängige rechteckige Mikrokanäle (200 µm Breite und 50 µm Höhe) miteinander verbunden, um die Flüssigkeit in die Mikrokammern einzuführen bzw. die Luft in den Mikrokammern abzulassen.

Schematische Darstellung des mikrofluidischen Diagnosegeräts, das eine sequentielle Flüssigkeitsabgabe für den Multiplex-Nachweis genetischer Allergene ermöglicht und unter Verwendung einer Kombination aus einem Soft-Lithographie-Prozess und einem Wachs-Reflow-Prozess hergestellt wird. (a) Ein hergestelltes PDMS-Mikrofluidikgerät, bestehend aus einer Anordnung von fünf Reaktionsmikrokammern (jeweils ~ 3 µL), wurde mit grün gefärbtem Wasser gefüllt. (b) Ein Stück Wachs wurde auf die Oberseite jedes SU-8-Kammerformmodells gelegt. (c) Halbellipsoidförmige Wachsformen mit gleichmäßiger Form nach 3-minütigem Erhitzen auf 135 °C. (d) Rasterelektronenmikroskopische Bilder der PDMS-Mikrokammer. (e) 3D-Bild und Querschnittsprofile der PDMS-Mikrokammer.

Der verwendete Herstellungsprozess kann kurz wie folgt beschrieben werden: Zunächst wurde ein negativ dicker Fotolack (SU-8 3050; MicroChem, Newton, MA, USA) auf einem 4-Zoll-Einkristall-Siliziumwafer (e-Prize, Yokohama, Japan) als Gussform in einem einstufigen Fotolithographieverfahren hergestellt. Um tiefe lokalisierte Mikrokammerstrukturen (max. 1 mm Tiefe) zu erzeugen, wurden anschließend gleichzeitig die SU-8-Form und Wachsstücke von 2,7 mg (Ferris File-A-Wax; Freeman Manufacturing & Supply, Avon, OH, USA) verwendet 2 Minuten lang einer Niederdruck-Luftplasma-Oberflächenbehandlung in einem Plasmaverascher (JPA300; J-Science Lab, Kyoto, Japan) bei einer Leistung von 150 W unterzogen. Anschließend wurden die Wachsstücke in der Mitte der Oberseite jedes SU-8-Kammermusters platziert (Abb. 1b). Anschließend wurde ein Reflow-Prozess durchgeführt, indem die Form mit den Wachsstücken 3 Minuten lang auf einer Heizplatte auf 135 °C erhitzt wurde (EC1200-N; AS ONE, Osaka, Japan). Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurden aufgrund der Oberflächenspannung des geschmolzenen Wachses halbellipsenförmige Kammerformen mit gleichmäßiger Form erhalten (Abb. 1c). Es ist zu beachten, dass die Plasmaoberflächenbehandlung der SU-8-Form und der Wachsstücke vor dem Reflow-Prozess die Haftfestigkeit zwischen ihnen deutlich verbesserte, wahrscheinlich aufgrund der Entfernung von Oberflächenverunreinigungen. Anschließend wurde die SU-8-Masterform mit den halbelliptischen Wachsstrukturen in PDMS (Silpot 184; Dow Corning Toray, Tokio, Japan) nachgebildet, nachdem sie 40 Minuten lang auf einer Heizplatte bei 80 °C ausgehärtet wurde. Nach dem Abziehen des PDMS von der SU-8-Masterform wurden mit einem Biopsie-Stanzwerkzeug (Kai Industries, Gifu, Japan) kreisförmige Löcher (mit einem Durchmesser von 1,0 mm) für einen Einlass und zwei Auslassanschlüsse in das PDMS-Mikrofluidikgerät gestanzt ). Schließlich wurden sowohl die Mikrokammern als auch die Mikrokanäle mit einer weißen Polyvinylchlorid (PVC)-Folie (EB-235; Hikari, Osaka, Japan) unter Verwendung eines doppelseitigen Klebebands auf Silikonbasis (Nr. 5303 W; Nitto Denko, Osaka, Japan) versiegelt. Japan). Abbildung 1d zeigt Bilder einer PMDS-Mikrokammer, die mit einem Rasterelektronenmikroskop (S-3000 N; Hitachi High-Tech, Tokio, Japan) aufgenommen wurden. Es wurde eine dreidimensionale (3D) PDMS-Mikrokammer mit einer extrem glatten, gekrümmten Oberfläche erhalten. Ein 3D-Bild und Querschnittsprofile der PDMS-Mikrokammer, aufgenommen mit einem Digitalmikroskop (VHX-7000; Keyence, Osaka, Japan), zeigten, dass die maximale Tiefe der semielliptischen PDMS-Mikrokammer etwa 1 mm betrug, dem erwarteten Designwert (Abb. 1e).

In dieser Studie wurden mit dem gleichen Verfahren auch mikrofluidische Geräte mit 10 Mikrokammern hergestellt, die in einer einzelnen Reihe oder in einem Kreis angeordnet waren. Um die Auswirkung von Luftleckagen an der Schnittstelle zwischen dem PDMS-Gerät und dem doppelseitigen Klebeband auf Silikonbasis zu untersuchen, haben wir außerdem ein modifiziertes PDMS-Gerät vorbereitet, das kovalent an eine dünne PDMS-Schicht gebunden wurde, die durch Schleuderbeschichtung auf ein 4-Zoll-Gerät aufgetragen wurde Glaswafer (AS-4; Toshin Riko, Tokio, Japan) durch Luftplasma-Oberflächenbehandlung. In Experimenten wurde eine Spritzenpumpe (YSP-201; YMC, Kyoto, Japan) oder eine druckbetriebene Mikropumpe (Flow EZ 7000 mbar, Fluigent SA, Le Kremlin-Bicêtre, Frankreich) verwendet, die mit einem Durchflusssensor (Flow Unit, Fluigent SA) ausgestattet war ) dienten zum Einbringen der Flüssigkeit in die Geräte. Mit einer Smartphone-Kamera wurden Videobilder des sequentiellen Flüssigkeitsabgabeprozesses in mehrere Mikrokammern und Fotos mehrerer Mikrokammern aufgenommen, um die Farbveränderung nach LAMP-Assays zu analysieren.

In unserer vorherigen Studie37 haben wir eine Methode zur sequentiellen Flüssigkeitsabgabe in mehrere Reaktionsmikrokammern eingeführt, indem wir die Berstdrücke in einem Paar passiver Absperrventile kontrollierten, die in jede Mikrokammer integriert waren (Abb. 2). Kurz gesagt, der Abgabevorgang war wie folgt: Zunächst stoppt der Flüssigkeitsfluss, nachdem er das passive Stoppventil S1 (ausgelegt mit Berstdruck P1) erreicht hat, das als temporäres Stoppventil fungiert, und wird in Richtung der Mikrokammer umgeleitet. Nachdem die Mikrokammer mit Flüssigkeit gefüllt ist, wird der Flüssigkeitsfluss am passiven Absperrventil S2 (ausgelegt mit Berstdruck P2) gestoppt, das als permanentes Absperrventil fungiert, und dann fließt die Flüssigkeit durch das Ventil in Richtung der zweiten Mikrokammer S1, weil P1 < P2. Ventil S2 hilft auch dabei, die Luft in den Mikrokammern abzusaugen. Durch Wiederholen dieses Vorgangs können alle Mikrokammern nacheinander mit Flüssigkeit gefüllt werden. Im Abgabeprozess können die mögliche Anzahl der abgegebenen Mikrokammern und die maximal zulässige Durchflussrate theoretisch durch die von uns vorgeschlagene Theorie der sequentiellen Flüssigkeitsabgabe bestimmt werden, die durch die folgende Gleichung beschrieben wird:

Dabei sind ΔP(L1), ΔP(L2) und ΔP(L3) die Druckunterschiede, die erforderlich sind, um eine Flüssigkeit in Mikrokanälen mit den charakteristischen Längen L1, L2 bzw. L3 fließen zu lassen, und m ist die Anzahl der vollständig gefüllten Mikrokammern gefüllt. Definitionen von L1, L2 und L3 finden Sie im nächsten Abschnitt. Der Strömungswiderstand innerhalb der Mikrokammer wird nicht berücksichtigt, da die Mikrokammer räumlich erheblich größer ist als die Mikrokanäle. Der theoretische Druckabfall ΔP(L) in einem rechteckigen Mikrokanal ergibt sich aus der folgenden Gleichung39:

Dabei sind W, H und L jeweils die Breite, Höhe und Länge des Mikrokanals, η die dynamische Viskosität der Flüssigkeit (η = 1 mPa·s für Wasser) und Q die volumetrische Durchflussrate.

Schematische Darstellung einer Methode zur sequentiellen Flüssigkeitsabgabe in mehrere Reaktionsmikrokammern. (a) Detailliertes Design von Mikrokammern mit einem Paar einseitiger Absperrventile mit unterschiedlichen Berstdrücken. (b) Optisches Mikroskopbild des permanenten Absperrventils S2. (c) Optisches Mikroskopbild des temporären Absperrventils S1.

Gemäß der Abgabetheorie (Gleichung 1) ist es zur Erhöhung der Durchflussrate bei gleicher möglicher Anzahl abgegebener Mikrokammern erforderlich, die Länge des Mikrokanals, insbesondere L1, zu verringern und den Berstdruck P1 des temporären Absperrventils S1 zu verringern. und den Berstdruck P2 des permanenten Absperrventils S2 erhöhen, wodurch die Zeit verkürzt wird, die zum Abgeben von Flüssigkeit in die Mikrokammern erforderlich ist. Der theoretische Berstdruck P(g) (Pa) des Ventils S1 wird wie folgt beschrieben37:

Dabei ist g der Spalt zwischen der vertikalen Seitenwand des Mikrokanals und der konvexen Struktur, die auf der gegenüberliegenden Seitenwand eingebettet ist (im Folgenden als „einseitiges Absperrventil“ bezeichnet), H die Höhe des Mikrokanals und θm der Wasserkontaktwinkel Für die Ober- und Seitenwandflächen des Mikrokanals bei einem schmalen Spalt (θm = 108° für PDMS) ist θf der Wasserkontaktwinkel für die Unterseite des Mikrokanals (θf = 102° für das doppelseitige Klebeband auf Silikonbasis ) und γ ist die Oberflächenspannung der Flüssigkeit (γ = 0,073 N/m für Wasser). Wenn der Eckenradius r an der Hinterkante der konvexen Struktur nicht vernachlässigbar ist, ist der Nenner g + r (1 ‒ cos β) im ersten Term der neu definierte Lückenabstand zwischen einer bestimmten Position an der Ecke in einem Winkel β und dem vertikale Seitenwand des Mikrokanals, wobei β der Winkel zwischen der Richtung senkrecht zur Längsrichtung des Mikrokanals und der Position des Flüssigkeits-Luft-Meniskus ist, der der Fixierung an der Ecke der konvexen Struktur entspricht. In dieser Studie untersuchten wir neu gestaltete Ventilkonfigurationen für das permanente Absperrventil S2, um die Druckwiderstandsleistung zu verbessern. Wir haben die theoretische und experimentelle Leistung der sequentiellen Flüssigkeitsabgabe in eine Reihe von Mikrokammern analysiert, indem wir ein doppelseitiges Absperrventil oder ein Luftsteckventil implementiert haben (die Konstruktionen der beiden Ventile werden im nächsten Abschnitt ausführlich beschrieben) und sie mit verglichen das des einseitigen Absperrventils, über das wir in unserer vorherigen Studie37 berichtet haben.

Das Ziel dieser Studie war die Einführung einer schnellen und einfachen Proben-zu-Antwort-Plattform für den Multiplex-Nachweis mehrerer Allergene in verarbeiteten Lebensmitteln in einem einzigen Vorgang. Wir haben die Möglichkeit des gleichzeitigen Nachweises von drei spezifischen DNA-Zielen aus Weizen, Buchweizen und Erdnuss mithilfe unseres neu entwickelten mikrofluidischen Diagnosegeräts mit 10 kreisförmig angeordneten Mikrokammern untersucht. Das Betriebsverfahren für den multiplexierten kolorimetrischen LAMP-Assay im mikrofluidischen Diagnosegerät zum gleichzeitigen genetischen Nachweis der drei Allergene ist wie folgt (ergänzende Abbildung S1): Zuerst 0,5 µL von drei spezifischen Primersätzen, die zur Amplifikation der gezielten Pflanzenallergengene entwickelt wurden (Nr. 2 und 7 für Weizen; Nr. 3 und 8 für Buchweizen; und Nr. 4 und 9 für Erdnuss) und 0,5 µL universeller Primer-Sets zur Identifizierung aller Pflanzenarten als Positivkontrolle (Nr. 5 und 10). Vorgetüpfelt und in jeder Reaktionskammer (Volumen ≈ 3 µL) auf einer Heizplatte bei 80 °C für 3 Minuten getrocknet. Anschließend wurden sowohl die Mikrokammern als auch die Mikrokanäle auf der PDMS-Oberfläche mit einer PVC-Folie und einem doppelseitigen Klebeband auf Silikonbasis versiegelt. Nach der Abgabe einer Mischung aus DNA-Probe und LAMP-Reagenzien in die mehreren Reaktionskammern mit einer Flussrate von 30 µL/min mithilfe der Spritzenpumpe wurden die Einlass- und Auslassöffnungen mit einem doppelseitigen Klebeband auf Silikonbasis zusammen mit einem Polyethylen versiegelt Terephthalat-Trennfolie auf einer Seite. Hierbei wird der Release Liner beidseitig laminiert, um die Klebeschichten des doppelseitigen Klebebandes abzudecken. Das mikrofluidische Gerät wurde außerdem mechanisch zwischen zwei Glasplatten (S9213; Matsunami Glass, Osaka, Japan) eingeklemmt, die auf beiden Seiten des Geräts angebracht waren, um ein Auslaufen an den Schnittstellen zwischen der PVC-Folie, dem PDMS und der Polyethylenterephthalat-Trennfolie zu verhindern. Um eine Verformung des Geräts durch das mechanische Einklemmen zu vermeiden, wurde das PDMS-Gerät zwischen zwei zusätzlichen Glasplatten eingeklemmt. Abschließend wurde das Gerät in ein Heißwasserbad (TB-2N; AS ONE, Osaka, Japan) getaucht, um die Ziel-DNA durch die LAMP-Reaktion unter isothermen Bedingungen bei 60 °C für 60 Minuten zu amplifizieren.

HNB (FUJIFILM Wako Pure Chemical, Osaka, Japan) wurde als Indikator für den sichtbaren kolorimetrischen Nachweis der LAMP-Reaktion und für die Bildanalyse zur Endpunktfarbquantifizierung verwendet. In unserer vorherigen Studie37 haben wir eine Methode entwickelt, um Farbunterschiede zwischen einer positiven Reaktion (Himmelblau) und einer negativen Reaktion (Violett) nach den LAMP-Tests quantitativ zu bewerten, basierend auf einer Darstellung des CIE L*a*b*-Farbraums ( CIELAB). Im CIELAB-Farbraum gibt L* die Helligkeit an und a* und b* sind Farbkoordinaten. Kurz gesagt, zunächst wurden die RGB-Werte für jede Mikrokammer mit ImageJ (Version 1.52a, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) anhand von Fotos quantifiziert, die mit einer Smartphone-Kamera aufgenommen wurden, und anschließend in XYZ-Tristimuluswerte in der CIE-XYZ-Farbe umgewandelt Raum. Die Farbparameterwerte L*, a* und b* wurden anhand der XYZ-Werte berechnet. Diese Berechnungsmethode wurde bereits ausführlich beschrieben40. HNB wurde der Mischung aus DNA-Probe und LAMP-Reagenzien in jeder Reaktionskammer in einer Endkonzentration von 150 µM zugesetzt. Zur Durchführung der LAMP-Reaktionen wurde das Loopamp DNA Amplification Kit (Eiken Chemical, Tokio, Japan), einschließlich einer 2 × Reaktionsmischung und einer thermostabilen Bst-DNA-Polymerase, verwendet. DNA wurde aus Weizen-, Buchweizen-, Erdnuss- und Teepflanzen (Camellia sinensis; als Negativkontrolle verwendet) mit einem TaKaRa NucleoSpin Plant II-Kit (Takara Bio, Shiga, Japan) extrahiert und mit einem NanoDrop 1000-Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientific) quantifiziert , Waltham, MA, USA). Vier Pflanzenproben, darunter T. aestivum (Gutschein-Nr. JU2021TA10), F. esculentum (Gutschein-Nr. JU2021FE11), A. hypogaea (Gutschein-Nr. JU2021AH12) und C. sinensis (Gutschein-Nr. JU2021CS13), wurden aus dem Botanischen Garten entnommen der Josai-Universität. Alle Exemplare wurden im Botanischen Garten der Josai-Universität deponiert.

In unseren früheren Studien 35, 36, 37 verwendeten wir halbkugelförmige Polymerkügelchen (2 mm Durchmesser; SAYAKOBO, Yokohama, Japan), um tiefe lokalisierte Mikrokammerstrukturen anstelle des Wachs-Reflow-Verfahrens zu erzeugen (ergänzende Abbildung S2). Die Polymerkügelchen wurden manuell mit einem Epoxidklebstoff (Araldite; Huntsman Japan, Kobe, Japan) bei Raumtemperatur 12 Stunden lang als Form auf jedes SU-8-Kammermuster geklebt. Dieser Herstellungsprozess führte zu einer geringen Reproduzierbarkeit der Mikrokammern, d. h. die geringe Kontrollierbarkeit der Dicke der Klebstoffschicht und das Herausdrücken von überschüssigem Klebstoff an der Klebeschnittstelle verringerte die Replikationsgenauigkeit, insbesondere am Schnittpunkt des Mikrokanals und des Eingangs der Mikrokammer. Solche Prozessfehler führten manchmal dazu, dass unerwartet Luftblasen in der Mikrokammer eingeschlossen wurden (Abb. 3a). Dieses ungünstige Ergebnis wurde höchstwahrscheinlich durch eine ungleichmäßige Strömung auf einer Stufe oder um ein Hindernis am Eingang der Mikrokammer verursacht. Die Wahrscheinlichkeit einer luftblasenfreien Probenabgabe lag bei Versuchen mit 20 Geräten und insgesamt 100 Kammern bei 87,0 %. Durch die Umsetzung des thermischen Reflow-Verfahrens mit Wachs konnte die Wahrscheinlichkeit einer luftblasenfreien Dosierung in Versuchen mit 20 Geräten und insgesamt 100 Kammern deutlich auf bis zu 100 % verbessert werden (Abb. 3b).

Vergleich des Flüssigkeitsabgabeverhaltens zwischen PDMS-Mikrokammern, die unter Verwendung von (a) halbkugelförmigen Polymerkügelchen und (b) dem Wachs-Reflow-Verfahren hergestellt wurden. Erstere zeigten gelegentlich unerwartete Luftblasen, die in den Mikrokammern eingeschlossen waren, letztere hingegen nicht.

In dieser Studie haben wir die Druckwiderstandsleistung des Ventils S2 durch Änderung seiner geometrischen Konfiguration verbessert. Wie in Abb. 4a dargestellt, wird der Spaltabstand des Ventils S2 durch zwei einander zugewandte konvexe Strukturen bestimmt, die in beide Seitenwände des Mikrokanals eingebettet sind (als Kapillarstoppventil41 bezeichnet). In unseren Geräten wird die Ventilstruktur von S2 im Folgenden als doppelseitiges Absperrventil bezeichnet, während es sich beim S1-Ventil um ein einseitiges Absperrventil handelt. Der theoretische Berstdruck des doppelseitigen Absperrventils lässt sich wie folgt ableiten:

Experimentelle Ergebnisse, die den Einfluss der Durchflussrate auf die Leistung der sequentiellen Flüssigkeitsabgabe in einer Anordnung von 10 Mikrokammern mit doppelseitigen Absperrventilen zeigen. (a) Detaillierter Entwurf der Reaktionsmikrokammern mit einem Paar passiver Absperrventile, einschließlich eines einseitigen Absperrventils als temporäres Absperrventil S1 und eines doppelseitigen Absperrventils als permanentes Absperrventil S2. Die Mikrokammern wurden nacheinander mit blau gefärbtem Wasser mit einer Durchflussrate von (b) 10, (c) 20 oder (d) 50 µL/min gefüllt.

Der Spaltabstand des doppelseitigen Absperrventils S2 wurde experimentell zu g2 = 21,4 μm gemessen (Abb. 4), was zu einem theoretischen Berstdruck P2 von 5,85 kPa für r2 = 6,4 μm in einem Mikrokanal (W = 202,1 μm und) führt H = 59,0 µm). Der theoretische Berstdruck des einseitigen Absperrventils mit demselben Spaltabstand (g2 = 21,4 μm) wurde zu P2 = 4,47 kPa berechnet. Somit kann der Berstdruck im Vergleich zu dem des einseitigen Absperrventils um das 1,3-fache erhöht werden, indem für S2 das doppelseitige Absperrventil eingesetzt wird. Es ist zu beachten, dass fünf S2-Paare in Reihe angeordnet waren (Abb. 4a), da wir davon ausgingen, dass der Spaltabstand (g2) und/oder der Eckradius (r2) eines oder mehrerer Ventile aufgrund unerwarteter Umstände nicht dem Konstruktionswert entsprechen würden Prozessfehler in der Softlithographie. Somit bestimmt dasjenige der fünf Ventile mit dem höchsten Berstdruck (P2) die tatsächliche Ventilleistungsgrenze in mikrofluidischen Geräten. Zum Vergleich: Der Spaltabstand g1 von 40,5 μm für das einseitige Absperrventil S1 führte zu einem theoretischen Berstdruck P1 von 2,79 kPa. Die Mikrokanallängen L1, L2 und L3 wurden auf 5,0 mm, 1,0 mm, 0,2 mm eingestellt, wie in Abb. 4a gezeigt.

Abbildung 4b zeigt, dass eine Anordnung von 10 Mikrokammern vollständig mit Wasser gefüllt war, das mit blauer Lebensmittelfarbe (0,1 % w/v) gefärbt war, als wir die druckbetriebene Mikropumpe mit einer Durchflussrate von 10 µL/min verwendeten. Wie erwartet wurde die mögliche Anzahl der Mikrokammern, die bei Verwendung des doppelseitigen Absperrventils S2 abgegeben werden können, um das 1,7-fache erhöht, verglichen mit den sechs Mikrokammern, die bei derselben Durchflussrate mit dem zuvor verwendeten einseitigen Absperrventil S2 erreicht werden konnten37. Allerdings verringerte sich, wie vom theoretischen Dosiermodell vorhergesagt, die mögliche Anzahl der abgegebenen Mikrokammern auf fünf und zwei, wenn die Flussrate auf 20 µL/min (Abb. 4c und Video S1) oder 50 µL/min (Abb. 4d) erhöht wurde. , jeweils.

Gemäß der in Gl. (1–4) wird die maximal zulässige Durchflussrate durch einen Anstieg des Strömungswiderstands ΔP(L1) begrenzt, der nicht nur proportional zur Durchflussrate, sondern auch proportional zur Anzahl der gefüllten Mikrokammern zunimmt. Bei Verwendung der geometrischen Abmessungen der Mikrokanäle und eines Paares passiver Absperrventile, wie sie in dieser Studie entworfen wurden, war die maximal zulässige Durchflussrate für die Abgabe von 10 Mikrokammern auf etwa 10 µL/min begrenzt. Es ist zu beachten, dass eine weitere Reduzierung des Spaltabstands (g2 = 20 µm als Designwert) des permanenten Absperrventils S2 die Druckbeständigkeit (P2) verbessern würde, sich jedoch negativ auf die Strukturierungsgenauigkeit der SU-8-Form auswirken würde durch Fotolithographie.

Daher schlagen wir eine neu gestaltete Ventilkonfiguration für das permanente Absperrventil vor, die wir als „Luftsteckventil“ bezeichnen. Wie in Abb. 5a gezeigt, wurde ein Satz von zwei doppelseitigen Absperrventilen S2 stromabwärts und stromaufwärts im oberen Mikrokanal (im Folgenden als Luftabsaug-Mikrokanal bezeichnet) platziert, um die Luft in den Mikrokammern abzulassen. Fünf S2-Paare wurden in Reihe angeordnet, um das Risiko unerwarteter Fehler im Herstellungsprozess zu vermeiden, wie im vorherigen Abschnitt erwähnt. Das markanteste Merkmal des hier vorgeschlagenen Luftsteckventils besteht darin, dass Luft in dem Teil des Luftauslass-Mikrokanals eingeschlossen wird, der zwei S2-Ventile benachbarter Mikrokammern verbindet, wenn die nächste Mikrokammer vollständig mit Flüssigkeit gefüllt ist (Abb. 5a). Beispielsweise sind beide S2-Ventile der ersten Mikrokammer dem auf der rechten Seite von Gleichung angegebenen Gesamtdruck ausgesetzt. (5a) während die zweite Mikrokammer mit Flüssigkeit gefüllt wird. Diese Bedingung entspricht dem Fall, in dem m = 1 in Gl. (1) und der auf die S2-Ventile ausgeübte Druck erreicht das Maximum, kurz bevor die Flüssigkeit die S2-Ventile der zweiten Mikrokammer erreicht. Sobald jedoch der Lufteinschluss zwischen den S2-Ventilen der ersten und zweiten Mikrokammer abgeschlossen ist, sinkt der auf die S2-Ventile der ersten Mikrokammer ausgeübte Druck auf den auf der rechten Seite von Gleichung angegebenen Druck. (5b) weil die Flüssigkeiten, die die beiden Ventile erreichen, durch den Luftstopfen gegeneinander drücken, was zu einem Ausgleich des ausgeübten Drucks führt.

Experimentelle Ergebnisse, die den Einfluss der Durchflussrate auf die Leistung der sequentiellen Flüssigkeitsabgabe in einer Anordnung von 10 Mikrokammern mit Lufteinsteckventilen zeigen. (a) Detaillierter Entwurf der Reaktionsmikrokammern mit dem Lufteinsteckventil als permanentes Absperrventil S2, bestehend aus einem Satz von zwei doppelseitigen Absperrventilen, die sich im Luftauslass-Mikrokanal gegenüberstehen. Die Mikrokammern wurden nacheinander mit grün gefärbtem Wasser mit einer Durchflussrate von (b) 10, (c) 30 oder (d) 70 µL/min gefüllt. LL steht auf den Fotos für Lecklänge.

Daraus lässt sich schließen, dass der Berstdruck P2 der permanenten Absperrventile S2 nur so ausgelegt sein sollte, dass er die durch Gleichung (1) gegebene Randbedingung erfüllt. (5a), d. h. sie dürfen nur so lange einen Strömungswiderstand aufweisen, bis die Flüssigkeit vollständig in die nächste Mikrokammer abgegeben wurde. Dies bedeutet auch, dass die Beschränkung der möglichen Anzahl der abgegebenen Mikrokammern durch die Implementierung des Luftsteckventils für S2 aufgehoben wurde.

Abbildung 5b–d zeigt, dass alle 10 Mikrokammern nacheinander mit Wasser gefüllt wurden, das grüne Lebensmittelfarbe (0,1 % w/v) enthielt, bei Flussraten von 10, 30 und 70 μL/min (Video S2). Somit ermöglichte das Luftsteckventil eine erfolgreiche Abgabe in alle 10 Mikrokammern bei Durchflussraten unter 70 μl/min. Gemäß der durch Gl. (5a) ist die theoretisch maximal zulässige Durchflussrate aufgrund der geometrischen Abmessungen der Mikrokanäle und des Paares passiver Absperrventile im in dieser Studie verwendeten Design auf etwa 70 µL/min für die Abgabe von 10 Mikrokammern begrenzt. Somit stimmten die experimentellen Ergebnisse zufriedenstellend mit der theoretisch vorhergesagten maximal zulässigen Durchflussrate überein. Die zulässige Durchflussrate, die mit der Implementierung des Luftsteckventils erreicht wurde, war siebenmal höher als die, die mit der vorherigen Ventilanordnung mit doppelseitigen Absperrventilen erreicht wurde, und 14-mal höher als die, die mit den in unserem Fall verwendeten einseitigen Absperrventilen erreicht wurde vorherige Studie (die maximal zulässige Flussrate betrug 5 μl/min für 10 Mikrokammern)37. Insbesondere die dramatische Verbesserung der Druckbeständigkeit der permanenten Absperrventile ermöglichte es uns, die Flüssigkeit manuell in das Mikrofluidikgerät einzuführen (Video S3; geschätzte mittlere Durchflussrate: ~ 40 µL/min).

Unerwartet beobachteten wir, dass der Flüssigkeits-Luft-Meniskus, der zuvor durch das Lufteinsteckventil festgehalten worden war, im Verlauf der Abgabe allmählich stromabwärts und an der ersten Mikrokammer sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts austrat (gelbe Pfeile in Abb. 5b). -D). Dieses unerwartete Ventilleckverhalten war höchstwahrscheinlich auf die Gasdurchlässigkeit von PDMS42 zurückzuführen. Die Leckagelänge (LL) schien nicht nur mit zunehmender stromaufwärtiger Position des Ventils im Gerät zuzunehmen, sondern auch mit zunehmender Durchflussrate. Abbildung 6a zeigt LL am Luftsteckventil stromabwärts jeder Mikrokammer bei Durchflussraten von 10–70 µL/min. Die LL-Werte wurden direkt nach der vollständigen Füllung der 10. Mikrokammer geschätzt. LL nahm allmählich ab, je weiter sich die Ventile weiter stromabwärts befanden, bis es 0,8 mm erreichte, und nahm danach mit einer größeren negativen Steigung ab. Fünf S2-Paare wurden in Reihe im Luftauslass-Mikrokanal angeordnet, was zu einer Gesamtlänge von 0,8 mm zwischen der Hinterkante der ersten Ventilkonvexstruktur (auf die Nullposition von LL eingestellt) und der Hinterkante des fünften Ventils führte ( Abb. 5a). Der Übergangsbereich nahe LL = 0,8 mm war höchstwahrscheinlich auf die geometrischen Unterschiede im Mikrokanal zurückzuführen, dh auf periodische Schwankungen der Mikrokanalbreite aufgrund der gegenüberliegenden konvexen Strukturen, die an beiden Seitenwänden des Mikrokanals eingebettet waren.

Experimentelle Analyse der Lecklänge (LL). (a) LL-Werte am Lufteinsteckventil hinter jeder Mikrokammer bei Durchflussraten von 10–70 µL/min. Offene und durchgezogene Symbole in der Grafik stellen Daten für PDMS-Mikrofluidikgeräte dar, die mit doppelseitigem Klebeband auf Silikonbasis versiegelt und kovalent an eine dünne PDMS-Schicht gebunden sind. (b) Die Daten für das PDMS-Gerät, das kovalent an eine dünne PDMS-Schicht gebunden war, die auf einem 4-Zoll-Glaswafer aufgetragen war, wurden als Funktion des Produkts aus dem auf jeden Luftstopfen ausgeübten Innendruck (P) und dem natürlichen Logarithmus erneut aufgetragen der Zeit (ln(t)).

Um die Auswirkung von Luftleckagen an der Schnittstelle zwischen dem PDMS-Gerät und dem doppelseitigen Klebeband auf Silikonbasis zu untersuchen, haben wir ein modifiziertes PDMS-Gerät vorbereitet, das durch Luft kovalent an eine dünne PDMS-Schicht gebunden wurde, die auf einem 4-Zoll-Glaswafer aufgetragen war Plasma-Oberflächenbehandlung. Die für das modifizierte PDMS-Gerät gemessenen LL-Werte sind ebenfalls in Abb. 6a dargestellt. Es ist ersichtlich, dass es keinen signifikanten Unterschied zwischen zwei Gerätetypen gab. Somit trat an der Schnittstelle zwischen PDMS-Gerät und Klebeband eine vernachlässigbare Luftleckage auf. Obwohl außerdem alle Luftsteckventile S2 einem in Gl. (5b) Unmittelbar nach Abschluss des Lufteinschlusses zwischen benachbarten Ventilen wies der zwischen der ersten und zweiten Mikrokammer eingeschlossene Luftstopfen einen größeren Innendruck auf als alle anderen stromabwärts gelegenen Luftstopfen (Abb. S3), dh der Innendruck stieg mit an Erhöhung der Anzahl der abgegebenen Mikrokammern gemäß Gl. (1). Daher kann davon ausgegangen werden, dass LL nicht nur bei weiter stromaufwärts angeordneten Luftstopfenventilen zunimmt, sondern auch bei einer höheren Durchflussrate aufgrund eines Anstiegs des Strömungswiderstands, der durch Gleichung (1) abgeschätzt werden kann. (2).

In Abb. 6b sind die Daten für das PDMS-Gerät, das kovalent an eine dünne PDMS-Schicht auf einem 4-Zoll-Glaswafer gebunden ist, als Funktion des Produkts aus dem auf jeden Luftstopfen ausgeübten Innendruck (P) und dem natürlichen Logarithmus aufgetragen der Zeit (ln(t)). P wurde theoretisch nach Gl. berechnet. (1) und t wurde experimentell als die Gesamtzeit bestimmt, die zwischen der Fertigstellung eines bestimmten Luftstopfens und der vollständigen Füllung aller 10 Mikrokammern mit Wasser verging. Die Daten sind in Tabelle S1 in den Zusatzinformationen aufgeführt. Wie in der Grafik dargestellt, wird LL unter den Bedingungen LL ≥ 0,8 mm unabhängig von der Durchflussrate und der Ventilposition wie folgt ausgedrückt:

wobei das Bestimmtheitsmaß (R2) auf 0,823 geschätzt wurde, was darauf hindeutet, dass die Annahme in Gl. (6) gilt. Daher können wir LL theoretisch sogar während des Entwurfsprozesses von Mikrofluidikgeräten vorhersagen. Es ist zu beachten, dass, wenn das Pumpen den Flüssigkeitsfluss in das Mikrofluidikgerät stoppte, der Einlassschlauch entfernt wurde und das Austreten von Flüssigkeit an den Lufteinsteckventilen deutlich reduziert wurde, da der Innendruck sowohl im Mikrokanal als auch in den Mikrokammern sofort abnahm sinkt auf Atmosphärendruck. Eine grundlegende Möglichkeit, das Leckageproblem zu überwinden, besteht darin, PDMS durch technische Kunststoffe mit geringerer Gasdurchlässigkeit zu ersetzen, wie z. B. Polymethylmethacrylat, Polycarbonat oder Cycloolefinpolymer.

Wir untersuchten die Möglichkeit des schnellen, gleichzeitigen Nachweises mehrerer lebensmittelallergener Substanzen, d. h. spezifischer DNA-Ziele aus Weizen (T. aestivum), Buchweizen (F. esculentum) und Erdnuss (A. hypogaea), durch die kolorimetrische LAMP-Methode unter Verwendung von a mikrofluidisches Gerät mit kreisförmiger Anordnung. Mit dem Ziel, ein mikrofluidisches Diagnosegerät für den gleichzeitigen genetischen Nachweis von sieben Allergenen in verarbeiteten Lebensmitteln bereitzustellen, haben wir zehn Mikrokammern kompakt in einem Kreis untergebracht, anstatt ein einreihiges Format zu verwenden. Wie in Abb. 7 dargestellt, konnte in einem Gerät mit kreisförmiger Anordnung grün gefärbtes Wasser (0,1 % w/v) erfolgreich nacheinander mit einer Flussrate von 30 µL/min in alle Mikrokammern abgegeben werden (Video S4). Unsere sequentielle Flüssigkeitsabgabemethode bietet erhebliche Flexibilität bei der Gestaltung mikrofluidischer Geräte und ermöglicht so die geometrische Gestaltung von 10 Mikrokammern, die kreisförmig angeordnet und kompakt innerhalb des äußersten Durchmessers von 20 mm untergebracht sind, der durch den Abluft-Mikrokanal gebildet wird. Die geometrischen Abmessungen dieses Gerätetyps wurden auf L1 = 1,52 mm, L2 = 0,80 mm und L3 = 0,89 mm ausgelegt. Die theoretisch maximal zulässige Durchflussrate für die Abgabe von Wasser in die 10 Mikrokammern wurde auf unter 160 µL/min geschätzt, die Spaltabstände betrugen g1 = 40,5 µm und g2 = 21,4 µm für die Ventile S1 und S2 bzw. den Eckradius auf der Rückseite Die Kante der konvexen Strukturen betrug r1 = r2 = 6,4 µm und die Breite und Höhe des Mikrokanals betrugen W = 202,1 µm bzw. H = 59,0 µm.

Optimal gestaltetes PDMS-Mikrofluidikgerät mit 10 Reaktionsmikrokammern (jeweils ~ 3 µL), die kreisförmig angeordnet und kompakt im äußersten Durchmesser von 20 mm untergebracht sind, der durch den Abluftmikrokanal gebildet wird, und für den multiplexierten genetischen Nachweis von Lebensmittelallergenen eingesetzt wird. Alle Mikrokammern wurden nacheinander mit grün gefärbtem Wasser mit einer Durchflussrate von 30 µL/min gefüllt.

Abbildung 8a zeigt ein experimentelles Ergebnis für den Nachweis weizenspezifischer DNA (Gesamt-DNA-Konzentration: 1,0 ng/µL) durch die kolorimetrische LAMP-Methode unter Verwendung des Mikrofluidikgeräts. Nachdem die mit den LAMP-Reagenzien vermischte Weizen-DNA-Probe in das Gerät eingeführt wurde, wurde der LAMP-Assay 60 Minuten lang in einem heißen Wasserbad bei 60 °C durchgeführt. Wie erwartet wurden in den Kammern 2, 5, 7 und 10 eindeutig positive Reaktionen beobachtet, die sich durch einen Farbwechsel von HNB (150 µM) in der LAMP-Reaktionslösung von Violett zu Himmelblau manifestierten, ohne falsch-positive und falsch-negative Ergebnisse. LAMP-Assays mit Buchweizen-DNA und Erdnuss-DNA ergaben tatsächlich positive Ergebnisse in den Kammern 3 und 8 (Ergänzende Abbildung S4a) bzw. 4 und 9 (Abb. S4b) sowie in den Kammern 5 und 10, die als Positivkontrolle dienten.

Mit einer Smartphone-Kamera aufgenommene Fotos, die den kolorimetrischen Nachweis von (a) Weizen-DNA (Nr. 2 und 7), (b) einer Mischung aus Weizen- und Buchweizen-DNA (Nr. 3 und 8), (c) einer Mischung aus Weizen, Buchweizen- und Erdnuss-DNA (Nr. 4 und 9) und (d) Teepflanzen-DNA als Negativkontrolle durch LAMP-Assays, die 60 Minuten lang bei 60 °C durchgeführt wurden. Universelle Primer-Sets zur Identifizierung aller Pflanzenarten wurden in den Kammern Nr. 5 und 10 als Positivkontrolle vorgetupft, wohingegen in den Kammern Nr. 1 und 6 als Negativkontrolle keine Primer vorgetupft wurden.

Abbildung 8b zeigt den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Lebensmittelallergene in einer Mischung aus Weizen-DNA und Buchweizen-DNA (Gesamt-DNA-Konzentration: jeweils 1,0 ng/µL) durch den LAMP-Assay; positive Reaktionen traten in den Kammern 2, 3, 5, 7, 8 und 10 auf, ohne dass es zu einer Kreuzkontamination kam. Multiplex-LAMP-Assays mit anderen Kombinationen der DNA-Proben, dh Mischungen aus Weizen-DNA und Erdnuss-DNA (Abb. S4c) und Buchweizen-DNA und Erdnuss-DNA (Abb. S4d), lieferten ebenfalls echte Testergebnisse. In ähnlicher Weise ergab eine Mischung aller drei DNA-Proben (jeweils 1,0 ng/µL) positive Reaktionen in allen Kammern mit Ausnahme der Kammern 1 und 6, die als Negativkontrolle dienten (Abb. 8c). Wenn dagegen aus einer Teepflanze extrahierte DNA (1,0 ng/µL) in das Gerät eingeführt wurde, wurde ein Farbwechsel von Violett zu Himmelblau nur in den Positivkontrollkammern (Nr. 5 und 10) beobachtet, ohne dass es zu falsch positiven Ergebnissen kam Reaktionen in den anderen Kammern (Abb. 8d).

Abbildung 9 zeigt die Verteilungen der Farbunterschiede, die in der a* − b*-Farbebene des CIELAB-Raums aus den in Abb. 8 dargestellten LAMP-Ergebnissen dargestellt sind (ähnlicherweise sind die in Abb. S4 dargestellten Daten in der ergänzenden Abbildung S5 dargestellt). Das Ergebnis zeigte, dass die Farben der positiven und negativen Gruppen nach 60-minütiger Durchführung der LAMP-Tests für jede Kombination der drei Lebensmittelallergene und der als Negativkontrolle verwendeten Teepflanze deutlich getrennt waren.

Farbverteilungen für positive (Himmelblau) und negative (violette) LAMP-Reaktionen (dargestellt in Abb. 8) für den Nachweis von drei Lebensmittelallergenen (Weizen, Buchweizen und Erdnuss) und Teepflanze als Negativkontrolle, dargestellt in der a *-b* chromatische Ebene des CIELAB-Farbraums. LAMP-Reaktionen wurden 60 Minuten lang bei 60 °C durchgeführt.

Mit dem Ziel, die Leistung PDMS-basierter Mikrofluidikgeräte für die schnelle und benutzerfreundliche Multiplex-Gendiagnostik zu verbessern, haben wir eine neu entwickelte Ventilkonfiguration vorgeschlagen, die als Luftsteckventil bezeichnet wird. Die Druckwiderstandsleistung des Lufteinsteckventils wurde deutlich verbessert, nachdem die Lufteinschlüsse zwischen den gegenüberliegenden Ventilen abgeschlossen waren. Durch den Ersatz der vorherigen Ventilanordnung mit doppelseitigen Absperrventilen durch Luftsteckventile, die als permanentes Absperrventil verwendet wurden, erhöhte sich die maximal zulässige Durchflussrate sequentiell deutlich um das bis zu 14-fache (~ 70 µL/min). Abgabe einer Flüssigkeit, um eine Anordnung von 10 Reaktionsmikrokammern zu füllen. Darüber hinaus wurde die Beschränkung der möglichen Anzahl der abgegebenen Mikrokammern durch die Implementierung des Luftsteckventils aufgehoben. Wir haben gezeigt, dass das hergestellte Mikrofluidikgerät den gleichzeitigen Nachweis von drei pflanzlichen Lebensmittelallergenen (Weizen, Buchweizen und Erdnuss) durch kolorimetrische LAMP-Assays ermöglicht, die 60 Minuten lang bei 60 °C in einem einzigen Vorgang durchgeführt werden, ohne dass es zu einer Kreuzkontamination zwischen den Reaktionsmikrokammern kommt. Es ist zu beachten, dass das Diagnosegerät mit einer geometrischen Konfiguration aus 10 Reaktionsmikrokammern entworfen werden könnte, die kreisförmig angeordnet und kompakt in einem äußersten Durchmesser von 20 mm untergebracht sind, da unsere sequentielle Flüssigkeitsabgabemethode erhebliche Flexibilität bei der Gestaltung mikrofluidischer Geräte bietet.

Um den Betriebsablauf zu vereinfachen, werden wir in zukünftigen Studien nicht nur eine Methode zur Vorspeicherung der LAMP-Reagenzien im Mikrofluidikgerät weiterentwickeln, sondern auch ein pumpenloses Mikrofluidikgerät, das auf einer Kombination aus Zentrifugalpumpen und Kapillarventilen basiert, ohne dass dies erforderlich ist für ein externes Pumpsystem (z. B. eine Spritze oder Druckpumpe). Das endgültige Ziel besteht darin, eine schnelle und einfache Diagnoseplattform mit direkter Probenanalyse zu entwickeln, die den gleichzeitigen Nachweis nicht nur aller sieben allergenen Inhaltsstoffe ermöglicht, die nach japanischem Recht gekennzeichnet werden müssen, also Weizen, Buchweizen, Erdnuss, Ei, Milch und Garnelen und Krabben, aber auch lebensmittelbedingte Krankheitserreger (z. B. Salmonella enterica, S. aureus, Campylobacter jejuni und E. coli O157:H7) mithilfe unseres Mikrofluidikgeräts, um die Lebensmittelsicherheit zu gewährleisten. Grundsätzlich ist es möglich, die Art des interessierenden Nukleinsäureziels (DNA/RNA) flexibel anzupassen; Somit kann diese äußerst vielseitige Technologie für den gemultiplexten genetischen Nachweis nicht nur von Allergenen, sondern auch von Infektionskrankheiten, die durch verschiedene Krankheitserreger (Viren, Bakterien, Pilze und Parasiten), giftige Pflanzen und illegale Drogen verursacht werden, vor Ort eingesetzt werden, ohne dass eine Genehmigung erforderlich ist die Notwendigkeit mühsamer und mehrfacher Operationen.

Alle für die Studie relevanten Daten sind im Artikel enthalten oder als ergänzende Informationen hochgeladen.

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Diese Forschung wurde teilweise durch das Adaptable and Seamless Technology Transfer Program through Target-driven R&D (A-STEP) der Japan Science and Technology Agency (JST) unter der Fördernummer JPMJTM20EG und das Cooperative Project for Innovative Research der Toyohashi University of Technology unterstützt , Japan. Die Autoren danken Editage (www.editage.com) für die Bearbeitung in englischer Sprache.

Fakultät für Maschinenbau, Toyohashi University of Technology, Toyohashi, Aichi, 441-8580, Japan

Daigo Natsuhara, Ryogo Saito, Koki Shirai, Shunya Okamoto, Moeto Nagai und Takayuki Shibata

Fakultät für Pharmazie und Pharmazeutische Wissenschaften, Josai-Universität, Sakado, Saitama, 350-0295, Japan

Sae Misawa und Masashi Kitamura

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Alle Autoren haben gleichermaßen zum Manuskript beigetragen. DN: Methodik, Untersuchung, Schreiben – ursprüngliche Entwurfsvorbereitung, SM: Methodik, Untersuchung, RS: Methodik, Untersuchung, KS: Methodik, Untersuchung, SO: Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Aufsicht, MN: Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Aufsicht, MK: Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Betreuung, Finanzierungseinwerbung, TS: Konzeptualisierung, Schreiben – Prüfung und Bearbeitung, Aufsicht, Projektverwaltung, Finanzierungseinwerbung.

Korrespondenz mit Daigo Natsuhara oder Takayuki Shibata.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Ergänzendes Video S1.

Ergänzendes Video S2.

Ergänzendes Video S3.

Ergänzungsvideo S4.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Natsuhara, D., Misawa, S., Saito, R. et al. Ein mikrofluidisches Diagnosegerät mit Luftsteckventilen zum gleichzeitigen genetischen Nachweis verschiedener Lebensmittelallergene. Sci Rep 12, 12852 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16945-2

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Eingegangen: 27. März 2022

Angenommen: 19. Juli 2022

Veröffentlicht: 27. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16945-2

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