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Dec 01, 2023

Ein optogenetischer Werkzeugkasten für Licht

Band Nature Communications

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 1034 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Antibiotika sind ein zentraler Kontrollmechanismus für die synthetische Biologie und Mikrobiologie. Resistenzgene werden verwendet, um gewünschte Zellen auszuwählen und Bakterienpopulationen zu regulieren, ihre Verwendung ist jedoch bisher weitgehend statisch. Eine präzise räumlich-zeitliche Kontrolle der Antibiotikaresistenz könnte eine Vielzahl von Anwendungen ermöglichen, die eine dynamische Kontrolle der Anfälligkeit und des Überlebens erfordern. Hier verwenden wir lichtinduzierbare Cre-Rekombinase, um die Expression von Medikamentenresistenzgenen in Escherichia coli zu aktivieren. Wir zeigen eine lichtaktivierte Resistenz gegen vier Antibiotika: Carbenicillin, Kanamycin, Chloramphenicol und Tetracyclin. Zellen, die blauem Licht ausgesetzt sind, überleben in Gegenwart tödlicher Antibiotikakonzentrationen, Zellen, die im Dunkeln gehalten werden, dagegen nicht. Um die Resistenzinduktion zu optimieren, variieren wir den Promotor, die Ribosomenbindungsstelle und die Stärke der Enzymvariante mithilfe von Konstrukten auf Chromosomen- und Plasmidbasis. Anschließend verknüpfen wir die induzierbare Resistenz mit der Expression eines heterologen Fettsäureenzyms, um die Produktion von Octansäure zu steigern. Diese optogenetischen Resistenzwerkzeuge ebnen den Weg für die räumlich-zeitliche Kontrolle des Zellüberlebens.

Antibiotikaresistenzgene werden in der synthetischen Biologie häufig eingesetzt. Sie werden in genetische Konstrukte eingebaut, um die Plasmidvermehrung sicherzustellen. Auch bei Klonierungsmethoden spielen Resistenzgene eine wichtige Rolle. Beispiele hierfür sind chromosomale Insertionen, bei denen die Expression von Resistenzgenen als selektiver Marker für eine erfolgreiche Integration genutzt werden kann1, oder die Erstellung von Transposon-Bibliotheken, bei denen Arzneimittelresistenz als Zwischenselektionsmechanismus genutzt wird, bevor sie gegen eine alternative Sequenz ausgetauscht wird2,3.

Obwohl Antibiotikaresistenzgene ein fester Bestandteil der Forschung in der synthetischen Biologie und der mikrobiellen Biotechnologie sind, gibt es nur wenige Methoden zur dynamischen Kontrolle ihrer Expression. Die Fähigkeit, Arzneimittelresistenzen räumlich und zeitlich zu kontrollieren, könnte neue Wege für die Forschung im Bereich der synthetischen Biologie eröffnen. Als Analogie: Als Sheth et al.4 einen induzierbaren Replikationsursprung entwickelten – ein weiteres allgegenwärtiges Merkmal in Konstrukten der synthetischen Biologie – löste dies neue Forschungsbereiche aus, darunter die Speicherung biologischer Daten5 und die Diagnostik von Riboschaltern ganzer Zellen6. Die räumlich-zeitliche Kontrolle der Arzneimittelresistenz könnte die räumliche Musterung in lebenden Biomaterialien7, die Auswahl einzelner Zellen aus mikrofluidischen Systemen8,9 und ein besseres Verständnis der Rolle der Dynamik bei der klinischen Antibiotikaresistenz10 ermöglichen. Resistenzen werden beispielsweise häufig durch horizontale Gentransferereignisse verbreitet11,12, die auf Einzelzellebene schwer zu überwachen und zu kontrollieren sind. Neue Kontrollsysteme bieten das Potenzial für zukünftige Studien, die quantifizieren, wie unterschiedliche räumlich-zeitliche Anordnungen von Zellen, die Resistenzen entwickeln, zu einer Proliferation oder einem Kollaps auf Populationsebene führen können.

Optogenetische Methoden sind ein leistungsstarkes und weit verbreitetes Instrument zur Kontrolle der Genexpression13. Die Abgabe von Licht an Zellen kann räumlich und zeitlich reguliert und direkt in Rechenabläufe integriert werden14,15. Optogenetische Systeme in Bakterien wurden zur Steuerung der Genexpression für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt13,16, unter anderem zur Steuerung des Stoffwechselflusses17, zur Regulierung des Darmmikrobioms18, zur Steuerung der Zellmorphologie19 und zur Regulierung der Kokulturdynamik20. Der Einsatz von Licht zur Kontrolle des Zellüberlebens war ein Schwerpunkt der mikrobiellen Technik bei allen Arten. Beispielsweise wurde die optogenetische Regulierung zur Kontrolle der Nourseothricin-Resistenz bei Saccharomyces cerevisiae21 und der Bleomycin-Resistenz bei Yarrowia lipolytica22 eingesetzt. Bei Escherichia coli wurde Licht zur Bekämpfung der Antibiotikaresistenz mithilfe individuell entwickelter lichtgeschützter Antibiotika23 oder durch Ausnutzung der natürlichen Lichtempfindlichkeit von Tetracyclin24 eingesetzt. Da diese Methoden jedoch ein sorgfältiges Protein-Engineering erfordern oder spezifische Eigenschaften eines einzelnen Medikaments nutzen, lassen sie sich nicht einfach auf verschiedene Resistenzmechanismen übertragen. Ein alternativer Ansatz nutzte einen lichtinduzierbaren Promotor, um die Chloramphenicol-Resistenz reversibel zu kontrollieren20,25. Eine solche Methode könnte auf andere Resistenzgene übertragen werden, die Experimente beschränkten sich jedoch auf die Kontrolle des Chloramphenicol-Acetyltransferase-Enzyms. Die ideale Plattform für lichtinduzierbare Resistenzen wäre sowohl für verschiedene Antibiotikaresistenzgene generalisierbar als auch über Antibiotikakonzentrationen hinweg abstimmbar, um vielfältige Studien in der synthetischen Biologie und Mikrobiologie flexibel zu ermöglichen.

Um diesen Bedarf zu decken, verwendeten wir die durch blaues Licht induzierbare Cre-Rekombinase OptoCreVvd2, um Antibiotikaresistenzgene zu aktivieren26. Mit diesem System schneiden wir einen loxP-flankierten Transkriptionsterminator zwischen einem Gen und einem Promotor heraus, was eine erhöhte Genexpression nach Exposition gegenüber 465 nm blauem Licht ermöglicht (Abb. 1a). Die Rekombinase-Technologie wurde erfolgreich für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt, die eine robuste und induzierbare Kontrolle der Genexpression erfordern, einschließlich genlogischer Schaltkreise und der Verfolgung der Zelllinie27,28,29. Wir haben dieses System aufgrund seiner relativ kurzen Aktivierungszeit, der Flexibilität im Konstruktdesign (das nur das Hinzufügen von loxP-Stellen erfordert) und der minimalen Basalexpression in nicht induzierten Zellen ausgewählt26. Darüber hinaus ermöglicht der durch Cre verursachte permanente AUS-EIN-Schalter die Auswahl resistenter Zellen zu jedem Zeitpunkt nach der Lichteinwirkung und ermöglicht so ein Zellgedächtnis, nachdem der Lichteintrag entfernt wurde. Obwohl diese Irreversibilität keine komplexe zeitliche Dynamik zulässt, bietet eine einmalige Induktion Vorteile, die in bestimmten Anwendungen vorteilhaft sein können, z. B. die Ermöglichung einer irreversiblen Aktivierung, bevor eine Kultur zu dicht für das Eindringen von Licht wird, oder die Minimierung der Exposition bei lichtempfindlichen Stämmen.

a Gespaltene Cre-Rekombinasefragmente sind mit durch blaues Licht induzierbaren Vvd-Photodimerdomänen verknüpft. Bei Einwirkung von blauem Licht wird Cre aktiv und kann einen Transkriptionsterminator zwischen zwei loxP-Domänen herausschneiden, was eine erhöhte Expression von Beta-Lactamase (bla) ermöglicht. Die Expression von OptoCre-bla ermöglicht es den Zellen dann, in Gegenwart des Antibiotikums Carbenicillin zu überleben. b Kurven der minimalen Hemmkonzentration (MIC) von chromosomal integrierten OptoCre-bla-Konstrukten, die 18 Stunden lang in Carbenicillin gezüchtet wurden. Lichtinduzierte Proben wurden unmittelbar vor der Carbenicillin-Exposition 2 Stunden lang blauem Licht ausgesetzt. Wachstum gemessen durch OD600 (n = 3). Die Stämme unter dunklen und hellen Bedingungen enthalten das Resistenzinduktionskonstrukt und OptoCreVvd2. Kontrollzellen (–) enthalten das Resistenzaktivierungskonstrukt, aber keine Cre-Rekombinase. Kontrollzellen (+) enthalten ein konstitutiv exprimiertes bla-Gen. Wildtyp-Zellen (WT) sind MG1655 ohne Modifikation oder Plasmide. c Zeitverlaufswachstum von OptoCre-bla-Resistenzaktivierungskonstrukten über verschiedene Carbenicillinkonzentrationen hinweg. d Anzahl der koloniebildenden Einheiten (KBE) von Kulturen aus MIC-Daten (n = 6). Nach 18-stündigem Wachstum in Carbenicillin wurden die Proben auf Agarplatten getüpfelt und die Kolonien am nächsten Tag gezählt. e Optimale OptoCre-bla-Aktivierungsbedingungen. Resistenzaktivierungskonstrukte wachsen in 300 µg/ml Carbenicillin nach 2-stündiger Einwirkung von blauem Licht, jedoch nicht, wenn sie im Dunkeln aufbewahrt werden. Das Wachstum wird durch OD600 nach 18 Stunden quantifiziert. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung um den Mittelwert (n = 3 biologische Replikate).

Hier verwendeten wir Cre, um die Expression von vier Antibiotikaresistenzgenen zu induzieren, die wir aufgrund ihrer Allgegenwärtigkeit in Anwendungen der synthetischen Biologie sowie ihrer vielfältigen Wirkmechanismen ausgewählt haben (Tabelle 1). Konkret haben wir uns für das Carbenicillin/Ampicillin-Resistenzgen Beta-Lactamase (bla) entschieden, das sowohl klinisch relevant ist als auch in der synthetischen Biologie weit verbreitet ist. Beta-Lactam-Antibiotika hemmen die Zellwandbiosynthese und werden durch das Beta-Lactamase-Enzym enzymatisch abgebaut12,30,31. Wir haben auch Kanamycin-Nukleotidyltransferase (knt) einbezogen, die eine enzymatische Resistenz gegen Kanamycin bietet, ein Antibiotikum, das eine Fehltranslation durch die ribosomale 30S-Untereinheit verursacht32. Chloramphenicol-Acetyltransferase (Katze) sorgt für eine enzymatische Resistenz gegen Chloramphenicol, das die ribosomale 50S-Untereinheit stört und zum Stillstand der Proteinsynthese führt33. Schließlich haben wir die Tetracyclin-Effluxpumpe A (tetA) als nicht-enzymatischen, Efflux-basierten Resistenzmechanismus einbezogen34. Tetracyclin bindet die ribosomale 30S-Untereinheit und hemmt so die Proteinsynthese35. Zu diesen vier Antibiotika zählen sowohl bakterizide (Carbenicillin/Ampicillin und Kanamycin) als auch bakteriostatische (Chloramphenicol und Tetracyclin) Arzneimittel. Diese Auswahl an Resistenzmechanismen zeigt sowohl die große Vielfalt an Mechanismen, die mit diesem System kontrolliert werden können, als auch stellt mehrere Optionen für synthetische Werkzeuge vor, die in bestehende Bakteriensysteme integriert werden können.

Bei der Kontrolle der Expression von Antibiotikaresistenzgenen gehören zu den wichtigsten Leistungsmetriken die nichtinduzierten und induzierten Expressionsniveaus. Wenn beispielsweise starke Enzyme wie Beta-Lactamasen verwendet werden, kann bereits eine geringe Basalexpression das Bakterienwachstum in Gegenwart eines Antibiotikums ermöglichen. Darüber hinaus sollte die Expression im induzierten Zustand auch ausreichen, um eine Resistenz bei Arzneimittelkonzentrationen bereitzustellen, die mit den typischen Arbeitsbereichen des Antibiotikums vergleichbar sind, die je nach Anwendungsfall weiter variieren können. Um diese beiden Funktionen in unserer Plattform zu optimieren, haben wir die Genkopienzahl, den Promotor, die Ribosomenbindungsstelle (RBS) und die kodierende Sequenz variiert, um die minimale Hemmkonzentration (MIC) des Antibiotikums einzustellen, bei der Zellen nach der Einwirkung von blauem Licht überleben Aufrechterhaltung eines Basalexpressionsniveaus, das niedrig genug ist, um ein irrtümliches Auslösen des Überlebens zu vermeiden. Wir haben außerdem die Live-Aktivierung von Resistenzgenen demonstriert und zelluläre Reaktionen mithilfe der Einzelzell-Zeitraffermikroskopie charakterisiert.

Schließlich haben wir den Nutzen lichtinduzierbarer Resistenzen in einer biotechnologischen Anwendung demonstriert, indem wir Resistenzgene mit der heterologen Thioesterase CpFatB1 coexprimierten, um die Produktion von Octansäure, einer mittelkettigen Fettsäure, zu steigern. Mittelkettige Fettsäuren sind hochwertige Biochemikalien, die in Kraftstoffen, der Polymerproduktion, Aromen und Duftstoffen verwendet werden, was sie zu wichtigen Zielen des Stoffwechsel-Engineerings macht36,37. Allerdings ist die Induktion von CpFatB1 metabolisch anstrengend, ein häufiges Problem bei der Expression heterologer Enzyme für Bioproduktionsanwendungen. Diese Herausforderung hat Forscher dazu veranlasst, Systeme zu entwickeln, bei denen der Zeitpunkt der Signalwegexpression präzise abgestimmt werden kann, um den Kompromiss zwischen Wachstum und Produktion auszugleichen38,39. Beispielsweise wurde Lichtinduktion verwendet, um die Produktion anderer Chemikalien in E. coli zu steigern, wie etwa Mevalonat und Isobutanol40. In unserem System mit OptoCreVvd2 erhöhte die Lichtinduktion von CpFatB1 in Verbindung mit der Antibiotikaselektion für eine hohe Expression des heterologen Enzyms die Fettsäureproduktion gegenüber der Lichtinduktion von CpFatB1 allein signifikant.

Dieses Toolkit lichtinduzierbarer Resistenzgene unterstützt und erweitert den langjährigen Einsatz von Antibiotika als zelluläre Kontrollmechanismen in der synthetischen Biologie, indem es bestehende Systeme um einen räumlichen und zeitlichen Kontrollmechanismus erweitert und die Voraussetzungen für zukünftige Anwendungen schafft, bei denen Licht in Kombination mit Antibiotika verwendet wird, um dies zu ermöglichen flexible Kontrolle des Zellverhaltens und Überlebens.

Zur optogenetischen Kontrolle von Resistenzgenen verwendeten wir die durch blaues Licht induzierbare gespaltene Cre-Rekombinase OptoCreVvd226. Dieses System ermöglicht die Entfernung genetischer Elemente, die zwischen loxP-Stellen platziert werden, wenn Zellen blauem Licht ausgesetzt werden. Die Exzision kann in ca. 2 Stunden abgeschlossen werden, was mit vielen bestehenden bakteriellen optogenetischen Systemen vergleichbar oder schneller ist19,25,41,42. Wir haben OptoCreVvd2 verwendet, um einen Transkriptionsterminator herauszuschneiden, der in loxP-Stellen zwischen einem Promotor und einem Antibiotikaresistenzgen platziert ist, sodass die Expression des Resistenzgens erst nach Einwirkung von blauem Licht möglich ist.

Wir verwendeten dieses System zunächst zur Steuerung der Transkription des Beta-Lactamase (bla)-Resistenzgens (das wir als „OptoCre-bla“ bezeichnen, Abb. 1a). Beta-Lactam-Antibiotika, einschließlich Ampicillin und Carbenicillin, hemmen die Biosynthese der Peptidoglycanschicht in der Bakterienzellwand. Beta-Lactamase-Enzyme können Beta-Lactam-Antibiotika inaktivieren, indem sie den Beta-Lactam-Ring des Antibiotikums hydrolysieren43. Für diese Studien verwendeten wir die TEM-116-Beta-Lactamase, die häufig in Antibiotikaresistenzkassetten zur Plasmidselektion verwendet wird44. Wir haben dieses genetische Konstrukt nach nupG in das E. coli MG1655-Chromosom integriert.

Um die lichtinduzierte Antibiotikaresistenz zu messen, haben wir OptoCre-bla-Kulturen 2 Stunden lang blauem Licht ausgesetzt, sie dann über Nacht in Gegenwart von Carbenicillin wachsen lassen und das Wachstum mit im Dunkeln gehaltenen Kulturen verglichen. Wir beobachteten blaulichtabhängige Unterschiede in der Zellproliferation, wobei die zur Verhinderung des Wachstums erforderliche MHK bei im Dunkeln gehaltenen Kulturen 300 µg/ml und bei Kulturen, die blauem Licht ausgesetzt waren, 1200 µg/ml betrug (Abb. 1b). Negativkontrollzellen (− Kontrollzellen), die nur den Reporter und keine Cre-Rekombinase enthielten, hatten ein vergleichbares Überleben wie Zellen mit dem vollständigen Konstrukt, das im Dunkeln gezüchtet wurde, was auf eine geringe Bla-Expression im nichtinduzierten Zustand hinweist. Positive Kontrollzellen (+Kontrolle) mit konstitutiver Expression von bla aus seinem nativen Promotor und RBS wuchsen in allen getesteten Carbenicillin-Konzentrationen, auch in Konzentrationen über dem lichtinduzierbaren Stamm, wie es für einen vollständig resistenten Stamm erwartet wird, der das Resistenzgen in seiner nativen Form exprimiert Kontext. Wir haben außerdem E. coli MG1655 als Wildtyp-Negativkontrolle einbezogen, die in keiner der hier verwendeten Carbenicillinkonzentrationen wuchs.

Um zu bestätigen, dass durch blaues Licht induzierte Zellen mit vergleichbaren Raten wie der positive Kontrollstamm wachsen, haben wir Zeitreihendaten gesammelt, die normale Wachstumsraten unter einem breiten Bereich von Carbenicillin-Konzentrationen für Zellen zeigen, die in blauem Licht gezüchtet wurden, während Zellen ohne Lichtinduktion nicht wuchsen (Abb. 1c). Wir haben die auf der optischen Dichte basierenden MIC-Daten weiter validiert, indem wir die Anzahl der koloniebildenden Einheiten (CFU) nach Antibiotika-Exposition verwendet haben (Abb. 1d). Obwohl die MHK-Daten eine genaue Beurteilung des Zellwachstums in Gegenwart eines Antibiotikums darstellen, verursachen Beta-Lactam-Antibiotika auch eine Zellfilamentierung, die die Werte der optischen Dichte (OD) erhöhen kann, selbst wenn sich die Zellen nicht teilen. Daher ist es besonders wichtig, die Bla-Resistenz durch CFU zu bestätigen Messung45. Unsere Ergebnisse anhand der CFU-Zählungen bestätigen jedoch, dass die Messungen der optischen Dichte auch zu einem deutlichen Unterschied im Zellüberleben führen46. Insgesamt stellten wir fest, dass OptoCreVvd2 zur Induktion einer Beta-Lactamase-Resistenz verwendet werden kann, und identifizierten Carbenicillin-Konzentrationen mit deutlichen Unterschieden zwischen der durch Dunkel- und Blaulicht aktivierten Expression des Bla-Resistenz-Genkonstrukts (Abb. 1e und Tabelle 2).

Als nächstes versuchten wir, dieses System auf andere Antibiotikaresistenzgene zu übertragen. Während die Entfernung eines Terminators leicht Licht an die Expression eines Antibiotikaresistenzgens koppeln kann, ist dies nicht dasselbe wie lichtinduziertes Überleben. Die Kontrolle des Überlebens erfordert keine oder nur eine geringe Expression des Antibiotikaresistenzgens im Dunkeln, sodass die Zellen anfällig für Antibiotika bleiben. Das Design erfordert außerdem, dass die Induktion des Resistenzgens ausreicht, um Resistenz zu verleihen. Die Schwellenwerte für diese beiden Merkmale können je nach Antibiotikaresistenzmechanismen, die unterschiedliche Geschwindigkeiten des Antibiotikaabbaus und -exports aufweisen, erheblich variieren. Während frühere Arbeiten in unserem Labor gezeigt haben, dass OptoCreVvd2 die Expression eines fluoreszierenden Proteins mit geringer Basalexpression und einer 10-fachen Veränderung durch Licht26 steuern kann, führt der naive Ersatz des Fluoreszenzgens durch ein Antibiotikaresistenzgen möglicherweise nicht zum gewünschten Verhalten. Daher haben wir einen allgemeinen Prozess zur Anpassung des OptoCreVvd2-Systems an verschiedene Antibiotikaresistenzgene (bla, knt, cat und tetA) definiert und konnten das Überleben in maßgeschneiderten Antibiotikakonzentrationsbereichen nachweisen.

Um unser System auf andere Antibiotika zu übertragen, haben wir zunächst in unserem Induktionskonstrukt bla gegen Kanamycin-Nukleotidyltransferase (knt) ausgetauscht, um OptoCre-knt herzustellen (Abb. 2a). Das Antibiotikum Kanamycin verursacht eine Fehlübersetzung, indem es an die 30S-Untereinheit des bakteriellen Ribosoms bindet. Das knt-Enzym katalysiert die Übertragung eines Nukleotids auf Kanamycin und inaktiviert so das Antibiotikum32. Obwohl unser ursprüngliches Design von OptoCre-knt eine Resistenzaktivierung durch Licht zeigte, war die Kanamycin-Konzentration, die erforderlich war, um diesen Unterschied zu erkennen, sehr hoch – über 1000 µg/ml (Abb. 2b), verglichen mit 25–50 µg/ml, die üblicherweise für Plasmide verwendet werden Ausbreitung24,44. Obwohl es nicht unbedingt erforderlich ist, die üblichen Arbeitskonzentrationen von Antibiotika anzupassen, bietet die Verwendung von Konzentrationen in der Nähe dieser Bereiche Vorteile, einschließlich der Möglichkeit, Auswirkungen auf die Gemeinschaft bei physiologischen Konzentrationen zu untersuchen und den Gesamtbedarf an Antibiotika zu begrenzen.

a Die Expressionsniveaus des Kanamycin-Resistenzgens knt können durch Änderung der Stärke des Promotors und der RBS sowie des Replikationsursprungs eingestellt werden. Die Stärke des Promotors reicht von P (mittel) über P* (mittel-niedrig) bis P** (niedrig). Die RBS-Stärke reicht von R (stark) bis R* (schwach). b MHK-Kurven von OptoCre-knt-Aktivierungskassetten auf dem Chromosom, mit Promotor P, P* oder P** und RBS R oder R* (n = 3). c MIC-Kurven von OptoCre-knt-Aktivierungskassetten auf einem Plasmid mit dem p15A-Replikationsursprung (n = 3). d Optimale OptoCre-knt-Aktivierungsbedingungen unter Verwendung von P* und R auf dem Chromosom bei 300 µg/ml Kanamycin. Das Wachstum wird durch OD600 nach 18 Stunden quantifiziert. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung um den Mittelwert (n = 3 biologische Replikate).

Daher haben wir uns zum Ziel gesetzt, die Genexpression durch Optimierung der genetischen Architektur rund um das Gen zu optimieren. Um die Basalexpression zu senken, haben wir den Promotor oder die RBS, die die knt-Expression antreiben, geschwächt. Durch die Änderung des Promotors und der RBS von OptoCre-knt konnten wir die Expression des Resistenzgens verschieben, um ein Überleben bei Antibiotikakonzentrationen zu ermöglichen, die viel näher an der MHK von Wildtyp-MG1655 liegen (Abb. 2b). Wir haben eine Reihe von Promotor- und RBS-Kombinationen getestet, um zu zeigen, wie sich diese Veränderungen auf das Überleben bei unterschiedlichen Antibiotikakonzentrationen auswirken. Wir verwendeten konstitutive Promotoren unterschiedlicher Stärke, die alle auf dem T7A1-Viruspromotor basierten und von mittlerer (P) über mittelniedrige (P*) bis niedrige (P**) Transkriptionsstärke reichten. Wir haben auch die RBS von Gen 10 im T7-Phagen47 verwendet, die wir mit R bezeichnen, und eine RBS, die wir rechnerisch so entworfen haben, dass sie schwächer ist48, die wir mit R* bezeichnen (Abb. 2a). Durch die Änderung von P zu P* verringerte sich die MHK für den dunklen Zustand auf 200 µg/ml Kanamycin, während P** sie weiter auf 150 µg/ml reduzierte (Abb. 2b). Die MHK für den hellen Zustand war erwartungsgemäß ebenfalls verringert, behielt jedoch immer noch einen weiten Bereich der Kanamycin-Konzentrationen bei, was zum Überleben führte. Bei P* führten Kanamycinspiegel zwischen 200 und 800 µg/ml zu einem lichtinduzierten Überleben, während der Bereich bei P** zwischen 150 und 500 µg/ml lag. Die Verwendung von R* in Kombination mit P verursachte einen dramatischen Rückgang sowohl der MHK im Dunkelzustand als auch der wirksamen Konzentrationen für das lichtinduzierte Überleben, was zu einem engen Bereich zwischen 4 und 6 µg/ml Kanamycin führte.

Obwohl die bisher verwendeten chromosomal integrierten Konstrukte die Vorteile einer geringen Hintergrundexpression aufweisen und keinen Selektionsmarker erfordern, bieten Plasmide ihre eigenen Vorteile für lichtinduzierbare Resistenzsysteme. Viele Resistenzgene kommen natürlicherweise auf Plasmiden vor, und ein Plasmidursprung ermöglicht einen bequemen Transfer von Systemen zwischen verschiedenen Stämmen. Wir haben unsere Konstrukte weiter auf Plasmiden charakterisiert, die den p15A-Replikationsursprung enthalten, der etwa zehn Kopien pro Zelle aufweist (Abb. 2c)49. Der Wechsel von der chromosomalen Integration zu einem p15A-Plasmid erhöhte den Bereich der Antibiotikakonzentrationen, bei denen Zellen, die OptoCre-knt enthalten, selektiv überleben, um mehr als das Fünffache. Trotz dieses Anstiegs haben wir festgestellt, dass Strategien wie die Verringerung der Promotor- oder RBS-Stärke einen ausgleichenden Effekt haben können. Wir haben auch ein auf dem Plasmid p15A basierendes OptoCre-bla charakterisiert, dessen Basalresistenz jedoch zu hoch war, um als funktionsfähig angesehen zu werden (ergänzende Abbildung 1a). Insgesamt macht das plasmidbasierte System mit OptoCre-knt den chromosomalen Insertionsprozess überflüssig, wodurch diese Konstrukte einfacher in verschiedenen Stämmen oder Kontexten verwendet werden können.

Die durch diese unterschiedlichen Designs gebotene Flexibilität veranlasste uns, mehrere Konstrukte zu entwickeln, und das optimale Konstrukt ist wahrscheinlich anwendungsspezifisch. Beispielsweise liegen die hier gezeigten niedrigeren Konzentrationen in der Nähe der Wildtyp-MHK, was optimal für Studien ist, die den Erwerb von Resistenzen mithilfe phänotypisch relevanter Antibiotikakonzentrationen charakterisieren möchten. Im Gegensatz dazu ermöglichen höhere Konzentrationen eine strengere Zellselektion für Studien, bei denen nur die aktivierten Zellen überleben sollten. Durch diesen Optimierungsprozess haben wir Konstrukte gefunden, die im Vergleich zu unserem ursprünglichen Konstrukt eine größere Kanamycin-MIC-Faltungsänderung zwischen dunklen und lichtexponierten Kulturen ermöglichen, insbesondere P* und R, die die OptoCre-knt-Expression auf dem Chromosom steuern. Dies ist ein ideales Beispiel für unser optimiertes Design (Abb. 2d und Tabelle 2).

Das lichtinduzierte Überleben erfordert einen strengen AUS-Zustand, in dem die Zellen anfällig für Antibiotika sind. Wie wir gezeigt haben, kann dies mit einer geringen Basalexpression des Resistenzgens erreicht werden. Der uninduzierte Zustand kann jedoch auch minimiert werden, wenn das Resistenzenzym selbst schwächer ist. Bei der Aktivierung des Enzyms Chloramphenicol-Acetyltransferase (Katze) nutzten wir daher eine bekannte Mutation, um die Stärke des Enzyms selbst zu verringern. Chloramphenicol verhindert die Proteinsynthese, indem es an die ribosomale 50S-Untereinheit bindet und dort die Bildung von Peptidbindungen hemmt. Das Katzenenzym verhindert, dass Chloramphenicol an das Ribosom bindet, indem es eine Acetylgruppe von Acetyl-CoA an das Antibiotikum bindet50. Durch die Verwendung der schwächeren catT172A-Variante51,52 senkten wir die Antibiotikakonzentration, bei der Zellen überleben (Abb. 3a). Im OptoCre-cat-Design verwendeten wir die Promotoren P und RBS R und verglichen das lichtinduzierte Überleben von cat und catT172A. Hier beobachteten wir bei catT172A im Vergleich zu cat eine stärkere Abnahme der Dunkel-OFF-State-Resistenz, wodurch die Basalresistenz gegenüber der des Wildtyp-Stammes auf einem chromosomal integrierten Konstrukt verringert wurde (Abb. 3b). Wir beobachteten auch einen Rückgang der MHK-Werte für cat und catT172A auf einem p15A-Plasmidursprung (Abb. 3c). Dieser Enzymmutantenansatz zur Optimierung kann besonders hilfreich sein, wenn mit Enzymen gearbeitet wird, die selbst bei minimaler basaler Genexpression eine Resistenz gegen hohe Antibiotikakonzentrationen zeigen, oder wenn dieses System auf einem Plasmid mit einer hohen Kopienzahl verwendet wird, bei dem es schwierig ist, die basale Expression zu begrenzen . Dieser Ansatz schafft einen weiteren Punkt, an dem Resistenzniveaus fein abgestimmt werden können, und der lichtinduzierte Wachstumsunterschied, den catT172A auf einem p15A-Plasmidursprung zeigt, ist ein besonders vielseitiges optimiertes Design (Abb. 3d und Tabelle 2).

Eine durch das Chloramphenicol-Resistenzgen cat gegebene Resistenz kann durch Verwendung der catT172A-Variante auf einem chromosomalen oder plasmidischen Ursprung verringert werden. b MHK-Kurven der OptoCre-cat-Aktivierungskassette mit dem nativen Enzym cat oder dem abgeschwächten Enzym catT172A auf dem Chromosom (n = 3). c MHK-Kurven der Aktivierungskassetten cat und catT172A auf einem Plasmid mit p15A-Ursprung (n = 3). d Optimale Aktivierungsbedingungen, Verwendung von catT172A mit Promotor P und RBS R auf einem Plasmidursprung bei 75 µg/ml Chloramphenicol. Das Wachstum wird durch OD600 nach 18 Stunden quantifiziert. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung um den Mittelwert (n = 3 biologische Replikate).

Wir haben uns gefragt, ob es möglich wäre, die Widerstandsstufen durch Anpassen der Lichteinwirkungseigenschaften anzupassen. Um dies zu testen, haben wir das OptoCre-cat-Design weiter charakterisiert, indem wir die Dauer und Intensität der Lichteinwirkung modifiziert haben (ergänzende Abbildung 2). Wir fanden heraus, dass die Widerstandsstufen einstellbar waren und von einer Kombination aus der Dauer der Lichteinwirkung und der Intensität des blauen Lichts abhingen.

Ein häufiges Problem bei vielen unserer Designs besteht darin, dass die Basalexpression zu Resistenzniveaus führt, die zwar niedrig sind, aber immer noch über denen des Wildtyp-Stammes liegen. Im Prinzip könnte diese Undichtigkeit das Ergebnis verschiedener Probleme sein, darunter spontane Rekombinationsereignisse, Mutationen im Terminator oder Durchlesen des Terminators. Wir sequenzierten die loxP- und Terminatorregion des (-)-Kontrollstamms ohne Cre unter den Bedingungen 0 µg/ml Chloramphenicol und 75 µg/ml Chloramphenicol, wobei letzterer den Zustand mit der höchsten Antibiotikakonzentration darstellt, der Wachstum zeigte. Die Sequenzierungsergebnisse beider Bedingungen stimmten mit der ursprünglichen Sequenz des Plasmids überein und bestätigten, dass die Leaky-Expression nicht das Ergebnis spontaner Rekombination oder Terminatormutationen ist. Diese Ergebnisse stimmen mit den Charakterisierungen des ursprünglichen OptoCreVvd2-Designs überein, das eine durchweg niedrige Basalexpression eines Fluorophors ohne Anzeichen einer spontanen Rekombination zeigte26. Um das Potenzial für das Durchlesen des Terminators zu verringern, haben wir dann versucht, die Basalexpression zu senken, indem wir den starken BBa_B0015-Terminator aus unserem ursprünglichen Design gegen den synthetischen Terminator L3S2P21 ausgetauscht haben, der der stärkste Terminator war, der in einem umfangreichen Satz identifiziert wurde, der in Chen et al.53 charakterisiert wurde. Dies zeigte jedoch keine weitere Verbesserung gegenüber dem in unserem ursprünglichen Design verwendeten Terminator (ergänzende Abbildung 3), sodass wir diesen Weg nicht weiter verfolgten. Für Anwendungen, bei denen eine minimale Basalexpression von entscheidender Bedeutung ist, könnten alternative Designs andere Terminatoren53,54 oder andere Schaltungsdesignansätze55,56,57 testen.

Die Lichtinduktion kann auch auf nicht-enzymatische Antibiotikaresistenzmechanismen angewendet werden, beispielsweise auf die tetA-Effluxpumpe. Das Antibiotikum Tetracyclin bindet reversibel an die ribosomale 30S-Untereinheit und hemmt so die Proteinsynthese. Die tetA-Effluxpumpe ist an der inneren Membran lokalisiert und exportiert Magnesium-Tetracyclin-Chelatkomplexe durch den Import eines Protons35. Im scharfen Gegensatz zu bla, knt und cat, wo die nativen Resistenzniveaus hoch waren und unsere technischen Bemühungen auf eine Verringerung der Wirksamkeit abzielten, stellten wir fest, dass unser ursprünglicher Entwurf für induzierbares tetA keine Resistenz gegenüber Wildtyp-MG1655 zeigte, wenn es mit Promotor P und exprimiert wurde RBS R auf einem p15A-Ursprungsplasmid (ergänzende Abbildung 1b), Bedingungen, die in den zuvor getesteten Konstrukten die höchsten Resistenzniveaus erzeugten. Um dies zu kompensieren, haben wir uns für die Verwendung des starken nativen Promotors Ptet mit seinem entsprechenden RBS Rtet entschieden, um die vollständige Expression des tetA-Gens58 zu ermöglichen und OptoCre-tetA zu erzeugen (Abb. 4a). Unter Verwendung dieser nativen Architektur zeigte OptoCre-tetA bei chromosomaler Integration eine gewisse Aktivierung (Abb. 4b) und zeigte eine starke Aktivierung am Ursprung des p15A-Plasmids (Abb. 4c). Bemerkenswert ist, dass die basale Resistenz im Dunkelzustand gegenüber Wildtyp-MG1655 minimal war, was die Aktivierung von OptoCre-tetA bei niedrigen Tetracyclinkonzentrationen ermöglichte. Wir fanden daher heraus, dass die auf dem Plasmid p15A basierende Version ein ideales Konstrukt für die Tetracyclinresistenz ist (Abb. 4d und Tabelle 2).

Ein Tetracyclin-Resistenzgen tetA wird unter Verwendung des nativen Promotors Ptet und des nativen RBS Rtet exprimiert, um eine maximale Expression des Gens zu ermöglichen. b MHK-Kurven von OptoCre-tetA auf dem Chromosom und c p15A-Plasmidursprung (n = 3). d Optimale OptoCre-tetA-Aktivierungsbedingungen unter Verwendung des p15A-Plasmidursprungs bei 4 µg/ml Tetracyclin. Das Wachstum wird durch OD600 nach 18 Stunden quantifiziert. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung um den Mittelwert (n = 3 biologische Replikate).

Die durch die Optogenetik ermöglichte räumliche und zeitliche Präzision ermöglicht die Verwendung dieser Konstrukte für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Einzelzellstudien zur bakteriellen Antibiotikaresistenz. Wie der Erwerb von Resistenzen zum Überleben von Bakterien auf Einzelzellebene führt, ist im Zusammenhang mit dem horizontalen Gentransfer von besonderem Interesse. Bestehende horizontale Einzelzell-Gentransferstudien haben zuvor die Gentransferraten charakterisiert und wichtige Zusammenhänge mit dem Quorum Sensing aufgezeigt59,60. Natürliche Vorfälle horizontalen Gentransfers sind jedoch selten und räumlich und zeitlich schwer zu kontrollieren, insbesondere im Vergleich zur Antibiotika-Exposition. Frühere Studien haben auch gezeigt, dass der stochastische Erwerb von Resistenz in einzelnen Zellen nicht immer ausreicht, um die Proliferation phänotypisch resistenter Zellen zu bewirken61. Um zu untersuchen, wann horizontale Gentransferereignisse zur Ausbreitung von Resistenzen in Populationen führen, wäre es interessant, den Resistenzerwerb einer einzelnen Zelle mit optogenetischer Kontrolle der Antibiotika-Empfindlichkeit zu modellieren. Dies könnte verwendet werden, um zu charakterisieren, wann und wie der Erwerb von Resistenzen in einzelnen Zellen zur Umgehung von Antibiotika führt und wie sich spezifische Dosierungspläne und Konzentrationen von Antibiotika auf die Umgehungshäufigkeit auswirken.

Hier zeigen wir einen Proof-of-Concept für die ersten Schritte in dieser Studienklasse, indem wir das Zellwachstum mithilfe von blauem Licht für Zellen auf Agarose-Pads induzieren. Mittels Zeitraffermikroskopie platzierten wir Zellen mit lichtaktivierbarer Antibiotikaresistenz auf antibiotikahaltigen Agarosepads und verglichen das Wachstum von Zellen, die im Dunkeln gehalten wurden, mit denen von Zellen, die blauem Licht ausgesetzt waren. Für diese Studien haben wir uns entschieden, uns auf eine Untergruppe von Resistenzgenen zu konzentrieren und Kanamycin und Chloramphenicol als Beispiele für bakterizide bzw. bakteriostatische Antibiotika auszuwählen. Wir charakterisierten die Resistenzaktivierung für die chromosomal integrierte OptoCre-knt-Resistenz gegen Kanamycin (Abb. 5a und Zusatzfilm 1) und die plasmidbasierte OptoCre-cat-Resistenz gegen Chloramphenicol (Abb. 5b und Zusatzfilm 2). Wir fanden heraus, dass Zellen mit lichtinduzierter Resistenz im Vergleich zu ihren konstitutiv resistenten Positivkontrollen eine kurze Verzögerung vor dem Wachstum zeigten, was wahrscheinlich der Zeit entspricht, die benötigt wird, um den Transkriptionsterminator herauszuschneiden und die Expression des Resistenzgens zu ermöglichen. Wenn die Zellen dagegen im Dunkeln gehalten wurden, wurde das Wachstum gehemmt und wir beobachteten Beispiele für den Verlust der Membranintegrität (Zusatzfilm 1–2). Um die Wiederherstellung resistenter Zellen zu quantifizieren, haben wir den Prozentsatz der Zellen im ersten Bild berechnet, die sich im Laufe des Films erholten (ergänzende Abbildung 4). Wir definierten den Zeitpunkt der Erholung als den Punkt, an dem sich eine Zelle zum ersten Mal teilt, und fanden bei Lichteinwirkung eine Erholung von 70 % für OptoCre-knt und 42 % für OptoCre-cat (im Vergleich zu 13 % und 4 % für Zellen im Dunkeln). obwohl insbesondere Zellen im Dunkeln selten mehr als ein Teilungsereignis erlebten, Zusatzfilm 1–2). Obwohl diese Daten deutliche Unterschiede zwischen Licht- und Dunkelexposition zeigen, können die unvollständigen Erholungsraten unter Lichtexposition auf die gleichzeitige Exposition gegenüber Antibiotika und Licht zurückzuführen sein, was wahrscheinlich dazu führt, dass einige Zellen nicht mehr lebensfähig sind, bevor sie induziert werden können. Zukünftig könnten mikrofluidische Experimente dabei helfen, die Wiederherstellungsraten als Funktion der relativen Lichtinduktion und des Zeitpunkts der Antibiotikazugabe zu bewerten.

Aktivierung a des chromosomalen OptoCre-knt-Resistenzkonstrukts mit Promotor P* und RBS R auf Agarose-Pads, die 400 µg/ml Kanamycin enthalten, und b des p15A-Plasmid-basierten OptoCre-cat-Resistenzkonstrukts unter Verwendung von catT172A mit Promotor P und RBS R auf Agarose-Pads enthält 60 µg/ml Chloramphenicol. Mikroskopische Bilder zeigen repräsentative Proben der Resistenzaktivierungsstämme im Dunkeln oder mit blauem Licht (Maßstabsbalken = 2 µm). Die Zellzahlen im Laufe der Zeit sind über mehrere Bildgebungspositionen hinweg für jede Bedingung kumulativ, wobei jede Parzelle den OptoCre-Resistenzstamm zusammen mit negativen und positiven Kontrollen (n = 3 biologische Replikate) enthält.

Mit Blick auf zukünftige Anwendungen, die die Kontrolle von Subpopulationen von Zellen erfordern, haben wir auch ein digitales Mikrospiegelgerät (DMD)62 verwendet, um Resistenzen in einer Untergruppe von Zellen zu aktivieren. Das DMD ermöglicht die programmierte Beleuchtung bestimmter Bereiche innerhalb eines Sichtfelds. Wir beleuchteten die Hälfte des Sichtfelds und sahen eine bevorzugte Aktivierung von Zellen im mit blauem Licht beleuchteten Bereich (ergänzende Abbildung 5). Wir beobachteten ein gewisses Wachstum in einer Untergruppe der Zellen in der dunklen Hälfte des Sichtfelds, wenn auch in geringerem Maße im Vergleich zur beleuchteten Hälfte. Dies kann auf die Lichtstreuung des DMD zurückzuführen sein, da wir diese Aktivierung erst nach Beginn der DMD-Beleuchtung sehen. Im Vergleich zu den längeren Belichtungen mit geringerer Intensität, die wir in Experimenten mit Flüssigkulturen verwendeten, ist der DMD darauf ausgelegt, intensive Lichtperioden zu liefern. Diese Unterschiede legen nahe, dass DMD-Aktivierungsprotokolle und -Setups für einen besseren Aktivierungszeitpunkt in der Zukunft optimiert werden könnten.

Um den Nutzen des Systems für biotechnologische Anwendungen zu demonstrieren, konzentrierten wir uns als nächstes auf die Steigerung der Octansäureausbeute durch Coexpression von cat oder tetA mit der Thioesterase CpFatB1 (Abb. 6a-b). CpFatB1 stammt aus der Pflanzenart Cuphea palustris und wurde für die Expression in E. coli optimiert63. Die Expression von CpFatB1 stellt eine Belastung für die Zellen dar, daher kann die direkte Kopplung ihrer induzierten Expression mit einer Antibiotikaresistenz ein selektives Wachstum von Zellen ermöglichen, die beide Enzyme aktiv produzieren, wodurch das Wachstum nicht exprimierender Zellen verhindert wird (Abb. 6c). Wir verwendeten OptoCre-cat mit der catT172A-Mutante und OptoCre-tetA zur Selektion aufgrund ihrer großen Induktionsbereiche und minimalen Basalwiderstände auf dem p15A-Plasmidrückgrat. Für die Fettsäureproduktion verwendeten wir die hochaktive Variante CpFatB1.2-M4-287, von der zuvor gezeigt wurde, dass sie die Octansäureproduktion steigert63. Um die Expression des CpFatB1-Gens zu optimieren, ohne die Architektur der Resistenzaktivierung zu stören, platzierten wir es unmittelbar stromabwärts des Resistenzgens unter Expression eines starken, rechnerisch entworfenen RBS mit der Bezeichnung R′. In Übereinstimmung mit dem Protokoll zur alleinigen Induktion einer Antibiotikaresistenz führten wir die Induktion durch, indem wir die Zellen zu Beginn der Wachstumsphase zwei Stunden lang blauem Licht aussetzten. Aus Sicht der Bioproduktion ist ein Vorteil des OptoCreVvd-Systems seine Irreversibilität, die eine dauerhafte Aktivierung von CpFatB1 ohne die Notwendigkeit einer kontinuierlichen Beleuchtung ermöglicht. Dadurch werden Probleme mit dynamischen Lichtinduktionssystemen umgangen, bei denen das Eindringen von Licht für dichte Zellkulturen in metabolischen Engineering-Kontexten zu einem Problem werden kann40,64. Wir fanden heraus, dass die Lichtinduktion allein zu einem signifikanten Anstieg der Octansäureproduktion sowohl im cat- als auch im tetA-System führte. Als nächstes fragten wir, ob die Einführung der Antibiotikaselektion die Erträge weiter verbessern könnte. Wir fanden heraus, dass mit OptoCre-cat die Zugabe von 150 µg/ml Chloramphenicol die Produktion deutlich steigerte und sie im Vergleich zur reinen Lichtinduktionsbedingung um 29 % steigerte, wobei höhere Chloramphenicol-Konzentrationen zu einer ähnlichen Leistung führten (Abb. 6d). Die Lichtinduktion allein oder mit Antibiotikum zeigte ebenfalls eine wesentliche Verbesserung der Ausbeute gegenüber einer konstitutiv exprimierten Version von CpFatB1 mit identischer genetischer Architektur und konstitutiver Cre-Rekombinase-Expression (Abb. 6d). Mit OptoCre-tetA stieg die Octansäureproduktion im Vergleich zur Lichtinduktion allein um 150 %, wenn es mit 1,5 µg/ml Tetracyclin ergänzt wurde (Abb. 6e). Höhere Tetracyclin-Konzentrationen verbesserten die Ausbeute weiter und erreichten bei Zugabe von 6 µg/ml Tetracyclin eine Steigerung von 300 % im Vergleich zu Licht allein. Diese Konzentrationen liegen im oberen Bereich der Resistenzwerte, die wir in unseren MIC-Experimenten für die jeweiligen Stämme sehen, möglicherweise aufgrund der höheren OD (OD600 ≈ 0,6) zum Zeitpunkt der Zugabe von Antibiotika in unserem Bioproduktionsprotokoll. Das Induktionssystem mit OptoCre-tetA steigerte die Produktion nicht gegenüber der konstitutiven Expression von CpFatB1, obwohl die Zugabe von Antibiotikum die Ausbeute gegenüber Licht allein deutlich verbesserte (Abb. 6e). Wichtig ist, dass die konstitutiv exprimierten Versionen sowohl des cat- als auch des tetA-Konstrukts im Vergleich zu den lichtinduzierbaren Versionen schlechte Wachstumsprofile zeigten (ergänzende Abbildung 6). Dieses Wachstumsdefizit in den konstitutiven Konstrukten ist problematisch, da es zu Escape-Mutanten führen und die Stabilität von Produktionsstämmen verringern kann. Somit führt die Kopplung der Octansäureproduktion mit der Resistenzselektion zu höheren Octansäureausbeuten als die Lichtinduktion allein, ohne das mit der kontinuierlichen Produktion verbundene belastende Wachstumsdefizit.

a Aktivierung von OptoCre-cat mit catT172A oder b OptoCre-tetA wird mit CpFatB1 gekoppelt, indem das Gen stromabwärts des Arzneimittelresistenzmarkers unter dem starken RBS R' eingeführt wird. c Blaues Licht induziert die Expression des Resistenzgens und von CpFatB1, garantiert jedoch nicht, dass alle Individuen innerhalb einer Gemeinschaft die Gene exprimieren. Nichtproduzenten haben aufgrund der Belastung durch CpFatB1 einen Wachstumsvorteil. Die Zugabe von Chloramphenicol verhindert das Wachstum von Individuen, die das Resistenzgen und folglich CpFatB1 nicht produzieren. d Octansäureproduktion gekoppelt mit OptoCre-cat, gemessen mittels GC-MS. e Octansäureproduktion gekoppelt mit OptoCre-tetA, gemessen mittels GC-MS. Die Signifikanz wurde mithilfe eines zweiseitigen Welch-t-Tests bestimmt: *P < 0,05; ns nicht signifikant. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung um den Mittelwert (n = 3 biologische Replikate).

Beim Vergleich der Konstrukte OptoCre-cat und OptoCre-tetA stellten wir fest, dass OptoCre-cat zwar insgesamt eine höhere Produktion zeigte, OptoCre-tetA jedoch einen stärkeren Produktionsanstieg mit steigenden Antibiotikakonzentrationen über den getesteten Bereich hinweg zeigte. Dies könnte auf den Unterschied zwischen Resistenztypen (enzymatisch vs. Efflux) und deren Einfluss auf die Populationsdynamik oder auf die unterschiedlichen Promotoren der Konstrukte (P vs. Ptet) zurückzuführen sein, was darauf hindeutet, dass diese Konstrukte und ihre Induktion wahrscheinlich weiter optimiert werden könnten die Produktion steigern. Diese Arbeit zeigt das Potenzial der Verwendung von Licht zur Kontrolle von Antibiotikaresistenzen für Anwendungen im Bereich Metabolic Engineering und Bioproduktion.

Wir haben optogenetisch kontrollierte Systeme für vier Antibiotikaresistenzgene entwickelt und optimiert. Mithilfe einer durch blaues Licht induzierbaren Cre-Rekombinase haben wir gezeigt, dass die Aktivierung von bla, knt, cat und tetA eine Resistenz über einen Bereich von Antibiotikakonzentrationen induziert. Diese Resistenzgene umfassen mehrere Mechanismen und stellen Antibiotika und Resistenzgene dar, die häufig in Labors für synthetische Biologie und Mikrobiologie verwendet werden. Ein entscheidender Aspekt beim Entwurf einer induzierbaren Resistenz ist das Ausmaß der Expression im nichtinduzierten und induzierten Zustand, und optimale Niveaus variieren dramatisch mit der Stärke des Resistenzgens. Daher haben wir Promotoren, RBSs und Enzymmutanten unterschiedlicher Stärke getestet, um Konstrukte zu finden, die eine optimale Basalexpression und fache Änderungen der Resistenzaktivierung zeigen. Um die Kopienzahl auf DNA-Ebene zu kontrollieren, verglichen wir auch Konstrukte, die chromosomal in der nupG-Region und auf einem p15A-Medium-Kopierplasmid integriert waren, was die Flexibilität im experimentellen Design verbesserte. Wir haben herausgefunden, dass die Optimierung von Resistenzinduktionskonstrukten auf der Ebene des Promotors, der RBS, des Enzyms und der Kopienzahl als verallgemeinerbarer Ansatz verwendet werden kann und mehrere Optionen zur Änderung der Expression bietet, um Flexibilität beim Konstruktdesign zu ermöglichen, um experimentellen Einschränkungen gerecht zu werden. Beispielsweise können Studien, die einen nativen Promotor, einen spezifischen Plasmidursprung oder ein bestimmtes Resistenzprotein erfordern, um mit anderen Elementen des Stammdesigns kompatibel zu sein, berücksichtigt werden, da dieses System an verschiedene Anwendungsfälle oder andere Resistenzgene angepasst werden kann. Dieses System ermöglicht auch die Erweiterung von Resistenzgenen über die hier gezeigten hinaus unter Verwendung der oben genannten Optimierungsansätze. Zukünftige Experimente zur direkten Charakterisierung des Ausdrucks könnten ebenfalls ein effektiver Weg zur weiteren Optimierung von Designs sein. Der Einsatz von Techniken wie qPCR oder Western Blots könnte eine relative Messung der Transkriptions- und Translationsniveaus ermöglichen, oder Proteinfusionen mit einem Fluorophor könnten eine Messung in Fällen ermöglichen, in denen die Fusion bekanntermaßen keinen Einfluss auf die Funktion hat.

Wir haben die vier Antibiotikaresistenzmechanismen hier so ausgewählt, dass sie sowohl für Anwendungen in der synthetischen Biologie als auch in der Mikrobiologie allgemein anwendbar sind. Diese Antibiotika und Resistenzgene werden häufig als Plasmid-Selektionsmarker und in Kontrollsystemen der synthetischen Biologie verwendet24,44. Als Beispiel für eine Anwendung könnten diese Konstrukte möglicherweise auf die Einzelzellselektion in mikrofluidischen Systemen angewendet werden. Die Auswahl einzelner Zellen von Interesse aus einem Mikrofluidikgerät ist eine Herausforderung, und aktuelle Methoden erfordern komplexe optische Fallen und ventilbasierte Mikrofluidikgeräte9. Die Kombination einer lichtinduzierbaren Resistenz mit einem DMD62 zur präzisen Ausrichtung des Lichts würde die antibiotische Selektion einer interessierenden Zelllinie aus dem Geräteausfluss ermöglichen, ohne dass Chipmodifikationen oder zusätzliche Hardwareanforderungen über die Lichteinwirkung hinaus erforderlich wären. Die Verwendung von Licht ermöglicht auch die Integration in Rechenabläufe und erleichtert möglicherweise das automatisierte Screening und die Auswahl interessanter Phänotypen. Der permanente Schalter würde sicherstellen, dass das Selektionssignal nicht verloren geht, sodass zu jedem Zeitpunkt nach der Aktivierung Nachkommen ausgewählter Bakterien zur Charakterisierung geerntet werden können. Angesichts der Verbreitung von Rekombinasen in der zellulären Logik28 könnte dieses System außerdem modular in größere Rekombinase-Schaltkreise integriert werden, um als logischer Ausgang das Zellüberleben zu steuern. Rekombinase-kontrollierte Resistenzgene könnten beispielsweise nur dann in großem Umfang zur Regulierung des Zellüberlebens eingesetzt werden, wenn bestimmte Umweltbedingungen (z. B. kleine Moleküle, Licht oder Temperatur) erfüllt sind28. In diesen Fällen kann es sinnvoll sein, anstelle der hier verwendeten IPTG-induzierbaren Version eine konstitutive Version von OptoCreVvd2 zu verwenden, um den Arbeitsablauf zu vereinfachen und die Anforderungen an die chemische Induktion zu minimieren. Da sowohl Rekombinasen als auch die ausgewählten Resistenzgene häufig in der synthetischen Biologie verwendet werden, ermöglicht dies die einfache Integration der optogenetischen Kontrolle in bestehende genetische Systeme.

Darüber hinaus gehen wir davon aus, dass diese lichtinduzierbaren Antibiotikaresistenzgene als synthetisches System zur Untersuchung des horizontalen Gentransfers nützlich sein könnten. Diese Systeme eignen sich gut, um zu untersuchen, wie der Erwerb von Einzelzell-Resistenzgenen zu einer Bevölkerungsausweitung oder einem Bevölkerungsrückgang führt. Durch die dauerhafte Aktivierung des „Erwerbs“ von Resistenzgenen mithilfe von Licht entfällt die Notwendigkeit, sich auf Beobachtungen seltener und stochastischer natürlicher horizontaler Gentransferereignisse zu verlassen. Insbesondere ist Bla im klinischen Umfeld besonders problematisch31 und wird bekanntermaßen stark übertragen, wenn der Darm Ampicillin ausgesetzt ist12. Neuere Studien, die sich mit einzelnen Zellen des horizontalen Gentransfers befassen, haben auch gezeigt, dass Quorum Sensing und Biofilmstrukturen bei der Auslösung von Transferereignissen wichtig sein können59,60, allerdings beschränkten sich die Experimente bisher auf die Untersuchung seltener horizontaler Transferereignisse. Da nicht alle Ereignisse des Resistenzerwerbs zur Proliferation resistenter Populationen führen61, könnte die synthetische Kontrolle des Resistenzerwerbs aufdecken, wann und wie sich Resistenz erwerbende Zellen vermehren. Zukünftig könnte dieses System auch so modifiziert werden, dass der Widerstand abgeschaltet oder reversibel gesteuert werden kann, was sowohl Untersuchungen zum Erwerb als auch zum Verlust von Resistenzen ermöglicht. Die Verwendung von Licht als Induktor ermöglicht auch Studien mit räumlicher Dynamik, die über das hinausgehen, was mit chemischer Induktion erreicht werden könnte. Bei komplexen räumlichen 3D-Geometrien kann die Lichtdurchdringung jedoch zu einem Problem werden. Insgesamt könnte die räumliche und zeitliche Kontrolle, die diese optogenetischen Systeme ermöglichen, es Forschern ermöglichen, zu bestimmen, welche zellulären Anordnungen und Antibiotika-Behandlungspläne zur Expansion oder zum Zusammenbruch mikrobieller Gemeinschaften führen, die aus resistenten Zellen und ihren anfälligen Nachbarn bestehen61,65.

Dieses System bietet auch neuartige Vorteile für synthetische Bioproduktionssysteme, die wir in einer Pilotstudie mit CpFatB1 zur Steigerung der Octansäureproduktion demonstriert haben. Obwohl effizient, stellen die Expression und die enzymatische Aktivität von CpFatB1 eine hohe Belastung dar, was zu einem Wachstumsvorteil für Nichtproduzenten führt und möglicherweise zu Betrügern führt63,66. Durch die Kopplung der Expression eines Resistenzgens mit dem Bioproduktionsenzym können wir das Wachstum auf nur Zellen beschränken, die CpFatB1 exprimieren, und so die Ausbeute gegenüber dem entsprechenden System mit Lichtinduktion allein weiter steigern. Diese Arbeit kann auf andere interessierende Bioproduktionsenzyme ausgeweitet oder mit mehreren Genen koexprimiert werden, um die Expression mehrerer Enzyme in einem Wachstumsweg zu erfordern.

Antibiotikaresistenzgene sind allgegenwärtige und grundlegende Werkzeuge der synthetischen Biologie. Allerdings gibt es derzeit nur wenige Methoden, die eine dynamische Regulierung ihrer Expression ermöglichen. Die Fähigkeit, Resistenzen mithilfe von Licht zu aktivieren, erweitert dieses Kernwerkzeug, verbessert die räumlich-zeitliche Kontrolle und ermöglicht neue Anwendungen in der Zellselektion und der Untersuchung des Erwerbs von Antibiotikaresistenzen.

Alle Antibiotikaresistenztests verwenden den E. coli-Stamm MG1655. Wir konstruierten Plasmide unter Verwendung der Gibson-Assemblierungsmethode 67 oder unter Verwendung der Golden Gate-Assemblierung 68 in Fällen, in denen die Konstrukte Fragmente mit einer Länge von weniger als 100 Basenpaaren enthielten (Ergänzungstabelle 1).

Chromosomal integrierte Konstrukte wurden unter Verwendung des Lambda-Red-Rekombinasesystems1 stromabwärts von nupG eingefügt (vorwärts gerichtete Homologiestelle: GGTTCTGGCCTTCGCGTTCATGGCGATGTTCAAATATAAACACGT, rückwärts: GGCGTGAAACGGTTGTACGGTTATGTGTTGAAGTAAGAATAA). Mit FRT-Stellen flankierte Antibiotikaresistenzkassetten wurden zur Auswahl erfolgreicher Integrationen verwendet (wir verwendeten knt für bla- und cat-Aktivierungskonstrukte, cat für knt- und tetA-Aktivierungskonstrukte); Diese Kassetten wurden dann mithilfe einer plasmidbasierten FLP-Rekombinase auf einem temperaturempfindlichen Ursprung gemäß dem Protokoll von Datsenko und Wanner1 ausgehärtet. Schließlich haben wir das temperaturempfindliche Plasmid vor weiteren Experimenten ausgehärtet.

Die für die OptoCreVvd2-Expression verwendeten Plasmide wurden von Sheets et al.26 abgeleitet. Für bla-Aktivierungsstudien haben wir die Plasmidselektionskassette von bla auf cat geändert und dabei das Gen aus den BglBrick-Plasmiden44 und die in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführten Primer verwendet. Die Antibiotikaresistenz-Aktivierungsplasmide wurden durch Ändern des jeweiligen Promotors, RBS und Reportergens von hergestellt pBbAk-W4-loxTTlox-mRFP1 von Sheets et al.26. Plasmid-Replikationsursprünge und Sequenzen für bla, knt und cat wurden der BglBrick-Plasmidserie44 entnommen. Die catT172A-Mutation wurde von Ciechonska et al.51 übernommen. Die Sequenz für tetA wurde aus dem von Hans-Martin Fischer69 hinterlegten AddGene-Plasmid Nr. 74110 (pRGD-TcR) erhalten. Die Sequenz für CpFatB1.2-M4-287 wurde von Hernández Lozada et al. erhalten. und mit Twist Bioscience63 synthetisiert. Konstitutive CpFatB1.2-M4-287-Expressionsstämme wurden durch Cotransformation derselben Reporter, die für die Lichtexpressionsexperimente verwendet wurden, mit pBbE5a-Cre erzeugt, das konstitutiv wirkt. Alle plasmidbasierten Resistenzkonstrukte enthalten den p15A-Ursprung. Plasmidbasierte Konstrukte für die knt-Aktivierung enthalten cat als Selektionsmarker, und Konstrukte für die bla-, cat- und tetA-Aktivierung enthalten knt als Plasmid-Selektionsmarker. Positivkontrollen für bla und tetA enthalten das jeweilige Gen mit seinem nativen Promotor und RBS auf einem Plasmid mit dem p15A-Ursprung. Positivkontrollen für knt und cat enthalten das jeweilige Gen mit seinem nativen Promotor und RBS auf einem Plasmid mit p15A-Ursprung für Studien mit einem plasmidbasierten Reporter oder integriert in die nupG-Region für Studien mit chromosomal integrierten Reportern. Als Promotoren wurden mittlere, mittelniedrige und niedrigstarke Varianten von T7 A170 verwendet, die mit P (TTATCAAAAAGAGTA TTGCAT TAAAGTCTAACCTATAG GAATCT TACAGCCATCGAGAGGGACACGGCGAA), P* (TTATCAAAAAGAGTA TTGTCT TAAAGTCTAACCTATAG GATTCT TACAGCCATCGAGAGGGACACGGCGAA) und P** (TTATCAAAAAGAGTA TTGTAA TAAA) bezeichnet wurden GTCTAACCTATAG GATTTT TACAGCCATCGAGAGGGACACGGCGAA). Unterstreichungen zeigen Mutationen vom ursprünglichen T7-A1-Promotor an. Die Ribosomenbindungsstelle R ist die RBS von Gen 10 im T7-Phagen (TTTAAGAAGGAGATATACAT)47. R* (ATCACTCTACGGCCAGCTGCAAAC) wurde rechnerisch unter Verwendung von De Novo DNA Version 2.1 so entworfen, dass es im Vergleich zu R (148 AU) eine zehnmal schwächere Translationsstärke (14,8 AU) aufweist, und R′ (TTTGTTTAATTACTAAGCGGGAGGTTAT) wurde für eine erhöhte Translationsstärke (100.000 AU) entwickelt48 ,71. Der rrnB-Terminator BBa_B0015, der im ursprünglichen pBbAk-W4-loxTTlox-mRFP1 von Sheets et al.26 verwendet wurde, wurde in allen Konstrukten als loxP-flankierter Terminator verwendet, sofern nicht anders angegeben. Der starke synthetische Terminator L3S2P2153 wurde von IDT synthetisiert und in eine mCherry-Variante des ursprünglichen fluoreszierenden Reporterplasmids kloniert. Primer, die zum Ändern jedes dieser Elemente verwendet werden, sind in der Ergänzungstabelle 1 enthalten.

Plasmide und Stämme aus dieser Studie und ihre Sequenzen sind auf AddGene (https://www.addgene.org/Mary_Dunlop/) verfügbar.

Stämme wurden über Nacht aus einer einzelnen Kolonie in selektivem LB-Medium gezüchtet, das 100 μg/ml Carbenicillin, 30 μg/ml Kanamycin oder 25 μg/ml Chloramphenicol enthielt, wie für die Plasmiderhaltung erforderlich. Die Kulturen wurden 1:100 in selektivem M9-Minimalmedium (M9-Salze, ergänzt mit 2 mM MgSO4, 0,1 mM CaCl2 und 0,1 % Glucose) für 2 Stunden mit 100 μM IPTG zur Induktion der OptoCreVvd2-Split-Rekombinase-Produktion aufgefrischt. Anschließend wurden die Kulturen entweder blauem Licht ausgesetzt oder 2 Stunden lang im Dunkeln gehalten. Die Lichtbelichtung erfolgte mit einem 24-Well-Lichtplattengerät (LPA)72 unter Verwendung von 1-ml-Kulturen mit zwei LEDs mit einer Wellenlänge von 465 nM pro Well (ThorLabs LED465E) und einer Gesamtleistung von 120 μW/cm2 pro Well. Für das Experiment zur Variation der Lichtintensität wurde der LPA verwendet, um 5, 60 oder 120 μW/cm2 für 0,5, 1 oder 2 Stunden nach dem gleichen Protokoll abzugeben.

Die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) wurden auf der Grundlage des von Wiegand et al.73 beschriebenen Protokolls gemessen. Antibiotika-Vorräte wurden durch Auflösen des Antibiotikums in sterilem destilliertem Wasser (Carbenicillin, Kanamycin, Tetracyclin) oder 99 %igem Ethanol (Chloramphenicol) hergestellt, wobei die Konzentrationen auf der Grundlage der CLSI-Standards auf die Wirksamkeit normalisiert wurden74. Testplatten zur Messung der MHK wurden durch serielle Verdünnungen des Antibiotikums in 100 μl M9-Minimalmedium in Platten mit 96 Vertiefungen hergestellt. Medien mit niedrigem Glukosegehalt wurden verwendet, um die Wachstumsvariabilität zu verringern, indem kohlenstofflimitierende statt nährstofflimitierende Wachstumsbedingungen geschaffen wurden45. Die Antibiotikakonzentrationen wurden so ausgewählt, dass sie Werte umfassen, die die MHK-Werte für die Kulturen im dunklen und hellen Zustand in jedem Experiment abdecken. Unmittelbar nach der Belichtung wurden die Kulturen durch Verdünnung auf die niedrigste optische Dichte (OD) jedes Experiments normalisiert. Normalisierte Kulturen wurden dann 1/25 in 96-Well-Platten in dreifacher Ausfertigung verdünnt und über Nacht 18 Stunden lang bei 37 °C gezüchtet. Anschließend wurde der OD-Absorptionswert jeder Vertiefung bei 600 nm (OD600) mit einem BioTek Synergy H1-Plattenlesegerät gemessen. Die Post-Proben-Sequenzierung für den OptoCre-cat-Reporterstamm allein wurde in Flüssigkultur unter den Wachstumsbedingungen 0 μg/ml und 75 μg/ml (knapp unter der MHK) am Ende der 18-stündigen Wachstumsperiode für die in der ergänzenden Abbildung gezeigten Proben durchgeführt 2. Die Proben wurden unter Verwendung der Phusion-Polymerase durch Vorwärts- (AAGCCATCCAGTTTACTTTG) und Rückwärts-Primer (CCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGG) amplifiziert, um die Terminatorregion einzuschließen.

Koloniebildende Einheiten (KBE) wurden nach dem von Sieuwerts et al.75 beschriebenen Micro-Spotting-Protokoll gemessen. Nachdem MIC-Platten 18 Stunden lang über Nacht gezüchtet wurden, wurden die Kulturen in einer 96-Well-Platte seriell 1:10 in 1x M9-Salzen verdünnt. Verdünnungen von 10–1 bis 10–6 wurden punktuell ausplattiert, mit 5 μl auf LB-Agarplatten in zweifacher Ausfertigung für jede Vertiefung (n = 6 für jede Bedingung). Die Platten wurden über Nacht bei 37 °C gezüchtet und die Kolonien wurden am nächsten Tag von Hand gezählt, um die niedrigste Verdünnung mit zählbaren Kolonien für jede Probe zu erreichen. Die KBE-Zahlen pro ml wurden dann berechnet, indem der Verdünnungsgrad mit der durchschnittlichen Anzahl der pro Bedingung gezählten Kolonien multipliziert wurde, wobei auf das ausplattierte Volumen von 5 μL normalisiert wurde.

Stämme wurden über Nacht aus einer einzelnen Kolonie in selektiven LB-Medien gezüchtet. Die Kulturen wurden 1:100 in selektivem M9-Minimalmedium für 2 Stunden mit 100 μM IPTG zur Induktion von OptoCreVvd2 aufgefrischt. Die Proben wurden dann auf 1,5 %ige niedrig schmelzende Agarose-Pads gelegt, die mit M9-Minimalmedium hergestellt wurden, das 100 μM IPTG und 400 μg/ml Kanamycin (knt-Aktivierung) oder 60 μg/ml Chloramphenicol (cat-Aktivierung) enthielt. Die Proben wurden bei 30 °C gezüchtet, um ein Austrocknen der Pads zu verhindern, und 18 Stunden lang alle 15 Minuten (knt-Aktivierung) oder 20 Minuten (catT172A-Aktivierung) abgebildet. Für Ganzbild-Beleuchtungsexperimente wurden Zellen mit einem Nikon Ti-E-Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung abgebildet. Die Blaulichtbelichtung erfolgte durch einen LED-Ring (Adafruit NeoPixel 1586), der über dem Mikroskoptisch befestigt war und von einem Arduino mit einem benutzerdefinierten Matlab-Skript gesteuert wurde, um eine Gesamtleistung von 330 μW/cm2 zu erzielen. Die Bilder wurden mit der Software DeLTA 2.076 segmentiert und analysiert. Zellteilungen wurden handschriftlich kommentiert. Für Experimente mit digitalen Mikrospiegelgeräten (DMD), die die Hälfte des Sichtfelds ausleuchten, wurden Zellen mit einem Nikon Ti-2-Mikroskop in 100-facher Vergrößerung abgebildet. Die Belichtung erfolgte durch ein DMD (Mightex Polygon 400), das an den Beleuchtungslichtweg des Nikon Ti-2-Chassis angeschlossen war. Licht vom DMD wurde 4 von 5 Minuten lang für jeden Bildgebungszyklus mit einer Gesamtleistung von 1,2 % oder 160 mW/cm2 durch einen 10 % Neutraldichtefilter (Chroma UVND 1.0) geleitet. Ein Arduino Uno-Mikrocontroller wurde verwendet, um die Kamera, die Beleuchtungsquelle und das DMD für die Bildaufnahme zu synchronisieren77.

Stämme wurden über Nacht aus einer einzelnen Kolonie in selektiven LB-Medien gezüchtet. Die Kulturen wurden 1:50 in selektivem M9-Minimalmedium mit 2 % Glucose78 und 100 μM IPTG für Stämme mit OptoCreVvd2 aufgefrischt. Die Kulturen wurden bis zu einer OD600 ≈ 0,2 gezüchtet. Anschließend wurden induzierte Kulturen, die OptoCreVvd2 enthielten, 2 Stunden lang blauem Licht ausgesetzt. Unmittelbar nach der Lichtexposition wurden 150, 300 oder 600 μg/ml Chloramphenicol oder 1,5, 3 oder 6 μg/ml Tetracyclin zu OptoCreVvd2-induzierten Zellen gegeben. Nach 20-stündigem Wachstum nach der Lichtinduktion wurden 400 μl der Kulturen entnommen und für die Quantifizierung durch Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) vorbereitet. Konstitutiv exprimierte CpFatB1-Stämme wurden unter identischen Bedingungen gezüchtet, erhielten jedoch weder Licht noch Antibiotika. Die Fettsäureextraktion und Derivatisierung zu Fettsäuremethylestern wurde wie von Sarria et al.79 beschrieben durchgeführt. Der Probe wurde ein interner Standard aus Nonansäure (C9) in einer Endkonzentration von 88,8 mg/L zugesetzt und vor der Extraktion verwirbelt. Die Proben wurden mit einem Agilent 6890 N/Agilent 5973 MS-Detektor unter Verwendung einer DB-5MS-Säule analysiert. Die Einlasstemperatur wurde auf 300 °C eingestellt, mit einer Durchflussrate von 4 ml/min. Das Ofenheizprogramm wurde zunächst für 1 Minute auf 70 °C eingestellt, gefolgt von einem Anstieg auf 290 °C mit 30 °C/Minute und einem abschließenden Halten bei 290 °C für 1 Minute. Der interne Nichtansäurestandard wurde zur Quantifizierung des Oktansäuretiters verwendet.

OD600-Werte in MHK-Kurven und Balkendiagrammen werden als Mittelwert von drei Proben ± Standardabweichung angegeben. Die Koloniezahlwerte für CFU-Messungen werden als Mittelwert von sechs Proben angegeben, die aus zwei Verdünnungen und Ausplattierungen für jeden MHK-Datenpunkt bestehen. Die mittels GC-MS gemessene Fettsäureproduktion wird als Mittelwert von drei biologischen Replikaten für jede Bedingung ± der Standardabweichung angegeben. Die statistische Signifikanz (P-Wert) für die Fettsäureproduktion wurde mithilfe eines zweiseitigen Welch-T-Tests bewertet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die zur Bewertung der Schlussfolgerungen erforderlichen Daten sind im Manuskript und/oder in den ergänzenden Materialien enthalten. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Der Bildanalysecode basiert auf dem DeLTA 2.0-Algorithmus, der unter https://gitlab.com/dunloplab/delta verfügbar ist.

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Wir danken Heidi Klumpe für ihre hilfreichen Kommentare zum Manuskript. Wir danken Caroline Blassick für die Schaffung der catT172A-Mutante und Mark Isalan für den Hinweis auf diese Variante. Diese Arbeit wurde durch den NIH-Zuschuss R01AI102922 und den DOE-Zuschuss DE-SC0019387 unterstützt. MBS erhielt Unterstützung durch das NIH-Trainingsstipendium T32 EB006359.

Abteilung für Biomedizintechnik, Boston University, Boston, MA, 02215, USA

Michael B. Sheets, Nathan Tague und Mary J. Dunlop

Biological Design Center, Boston University, Boston, MA, 02215, USA

Michael B. Sheets, Nathan Tague und Mary J. Dunlop

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MBS und MJD konzipierten und gestalteten die Experimente. MBS führte Widerstandsinduktionsexperimente durch und analysierte die Daten. MBS und NT führten Experimente zur Fettsäureproduktion durch und analysierten die Daten. MBS und MJD haben das Manuskript mit Beiträgen von NT verfasst

Korrespondenz mit Mary J. Dunlop.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Sheets, MB, Tague, N. & Dunlop, MJ Ein optogenetisches Toolkit für lichtinduzierbare Antibiotikaresistenz. Nat Commun 14, 1034 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36670-2

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Eingegangen: 10. Juni 2022

Angenommen: 13. Februar 2023

Veröffentlicht: 23. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36670-2

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