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Sep 12, 2023

Quantifizierung der biologischen Stickstofffixierung durch Mo

Wissenschaftliche Berichte Band 12,

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 22011 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die biologische Stickstofffixierung (BNF) durch kanonisches Molybdän und komplementäre Vanadium- und reine Eisen-Nitrogenase-Isoformen ist die primäre natürliche Quelle für neu fixierten Stickstoff. Um die Kontrollen des globalen Stickstoffkreislaufs zu verstehen, ist die Kenntnis der Isoform erforderlich, die für BNF in der Umwelt verantwortlich ist. Der Isotopic Acetylene Reduction Assay (ISARA), der die kohlenstoffstabile Isotopenfraktionierung (13C/12C) zwischen Ethylen und Acetylen in Acetylenreduktionsassays misst, ist eine der wenigen Methoden, mit denen isoformspezifische BNF-Flüsse quantifiziert werden können. Die Anwendung des klassischen ISARA war eine Herausforderung, da die BNF-Aktivität in der Umwelt oft zu gering ist, um ausreichend Ethylen für Isotopenanalysen zu erzeugen. Hier beschreiben wir eine hochempfindliche Methode zur Messung von Ethylen δ13C durch Inline-Kopplung der Ethylen-Vorkonzentration mit der Gaschromatographie-Verbrennungs-Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie (EPCon-GC-C-IRMS). Der Ethylenbedarf in Proben mit 10 % v/v Acetylen wird von > 500 auf ~ 20 ppmv (~ 2 ppmv bei vorheriger Offline-Acetylenentfernung) reduziert. Um die Robustheit durch Reduzierung von Kalibrierungsfehlern zu erhöhen, stützen sich einzelne Nitrogenase-Isoform-Mutanten von Azotobacter vinelandii und Umweltprobentests auf eine gemeinsame Acetylenquelle für die Ethylenproduktion. Die Anwendung der ISARA-Methode mit geringer BNF-Aktivität (LISARA) auf Böden mit geringer Stickstofffixierungsaktivität, Laubstreu, verrottetem Holz, Kryptogamen und Termiten deutet auf komplementären BNF in den meisten Probentypen hin, was zusätzliche Studien zu isoformspezifischem BNF erfordert.

Stickstoff (N) setzt im Wesentlichen die Grenzen der biologischen Produktivität und schränkt wahrscheinlich die Reaktionen natürlicher Ökosysteme auf globale Umweltveränderungen ein1,2,3. Die biologische Stickstofffixierung (BNF), der prokaryotische Prozess, der atmosphärischen Stickstoff (N2) in Ammoniak umwandelt, ist der primäre biologische Input von neuem bioverfügbarem N für den globalen und regionalen N-Haushalt. Es spielt somit eine wichtige biogeochemische Funktion in verschiedenen Ökosystemen, einschließlich tropischer, gemäßigter und hoher Breitenwälder, Berggras und Buschland sowie benthischer und offener Meeresumgebungen4,5. Nitrogenase, das für BNF verantwortliche Metalloenzym, existiert in drei primären Isoformen, die durch das im aktiven Zentrum vorhandene Übergangsmetall gekennzeichnet sind: die kanonische Nitrogenase und die „alternative“, oder neuerdings auch „komplementäre“ reine Vanadium (V) und Eisen ( Nur-Fe-Nitrogenasen6,7. Die reinen V- und Fe-Nitrogenasen sind Mo-unabhängig und enthalten anstelle von Mo8 die häufiger vorkommenden Spurenmetalle V und Fe aus der Kruste.

Die Bestimmung des Beitrags der verschiedenen Nitrogenase-Isoformen zum BNF in der Umwelt ist entscheidend für das Verständnis der mechanistischen Kontrollen des BNF im Ökosystem, insbesondere für die Reaktion der gekoppelten biogeochemischen Kreisläufe von Makronährstoffen und biologisch aktiven Spurenmetallen auf anthropogene Störungen. Da Berechnungen der BNF-Rate auf der Grundlage herkömmlicher Methoden (z. B. Acetylenreduktionstests und 15N/14N-Methoden zur natürlichen Häufigkeit) empfindlich auf die Nitrogenase-Isoform reagieren9,10,11, kann eine falsche Zuordnung der in BNF aktiven Nitrogenase-Isoformen die Schätzungen des N-Budgets um etwa 100 % verändern bis zu 50 %12,13, was den N-Status und die Bewirtschaftung des Ökosystems beeinflusst.

Die Metallspezifität von BNF-Flüssen in der Umwelt kann jetzt mithilfe der Isoform-spezifischen Flussverfolgung über den Isotopic Acetylene Reduction Assay (ISARA) und Ethanausbeutemethoden in Kombination mit Nitrogenase-Gensequenzanalysen bewertet werden6,12,13,14. Diese Ansätze haben signifikante Beiträge von komplementären V- und Fe-only-Nitrogenasen zu nicht-rhizobialem BNF in verschiedenen Proben identifiziert, die von Mangroven-Blattstreu der gemäßigten Everglades, Salzwiesensedimenten der gemäßigten Küstenregionen und borealen Cyanolichens reichen12,13,15,16. Kürzlich lieferte eine Studie über Cyanolichen-BNF über einen 600 km langen Nährstoffgradienten in einem borealen Wald den ersten Beweis im Ökosystemmaßstab für die Rolle der V-Nitrogenase bei der Aufrechterhaltung der BNF-Einträge unter Mo-limitierten Bedingungen13 und bestätigte damit eine seit langem vertretene Hypothese über die „Sicherung“. Rolle komplementärer Nitrogenasen, die ursprünglich durch Laborstudien vorgeschlagen wurde17. Darüber hinaus wurden niedrige Verhältnisse der Acetylen-zu-Stickstoff-Reduktionsaktivität (d. h. R-Verhältnisse), die auf komplementäres BNF schließen lassen, für gemäßigte Böden9, boreales Moos11,18 und verrottendes Holz19 beobachtet. Darüber hinaus wurden komplementäre und nicht charakterisierte Nitrogenase-Gene in Holzmulch20, Termitenhinterdärmen21, Boden9, Moos22 und Cyanolichens23,24 nachgewiesen. Diese Studien legen zusammen mit der Anhäufung von Beispielen von Mo-limitiertem BNF in borealen18,25,26, gemäßigten und tropischen Waldbiomen27,28,29,30,31,32,33 nahe, dass Mo-unabhängiges, komplementäres BNF eine globale Rolle spielen könnte. Dennoch war die Quantifizierung der Mo-unabhängigen BNF-Raten in Umweltproben, die häufig eine geringe BNF-Aktivität aufweisen, eine Herausforderung, da die zuverlässigste Methode zur komplementären BNF-Zuordnung, ISARA12, viel höhere Ethylenausbeuten erfordert, als typischerweise beobachtet werden (z. B. Boden, Moos). Laubstreu erzeugt in der Regel < 300 ppmv Ethylen über 1–2-tägige Inkubationen mit dem Acetylenreduktionstest. Eine umfassendere Untersuchung des komplementären BNF und seiner Kontrollen in wichtigen Ökosystemen erfordert methodische Verbesserungen von ISARA.

Die ISARA-Methode, die auf dem weit verbreiteten Acetylene Reduction Assay (ARA)-Proxy für die BNF-Aktivität basiert, basiert auf der natürlich vorkommenden kohlenstoffstabilen Isotopenfraktionierung 13C/12C der Acetylenreduktion zu Ethylen (13εAR = δ13Cacetylen – δ13Cethylen, wobei δ13C (‰) = ( [(13C/12C)Probe/(13C/12C)Standard) − 1] × 1.000), um die Aktivität der verschiedenen Nitrogenase-Isozyme zu quantifizieren12. Headspace-Proben aus ARA-Inkubationen werden durch manuelle Injektion in ein Gaschromatograph-Verbrennungsreaktor-Isotopenverhältnis-Massenspektrometer (GC-C-IRMS, Abb. 1a) analysiert. Ethylen (C2H4) wird im Kopfraum (typischerweise Kohlendioxid (CO2), Wasser (H2O), Methan (CH4) und Acetylen (C2H2)) durch Gaschromatographie von anderen Bestandteilen getrennt. Anschließend wandelt der Verbrennungsreaktor Ethylen in CO2 um durch IRMS-Messung des 13C/12C-Verhältnisses des produzierten CO2, das dem 13C/12C von Ethylen entspricht. Ein ähnlicher Prozess ergibt das 13C/12C von Acetylen. Mit den derzeit implementierten Methoden sind mehrere technische Einschränkungen und Schwierigkeiten verbunden. Erstens gibt es einen Kompromiss zwischen der analytischen Empfindlichkeit (d. h. der Größe des pro Einheit Ethylenkonzentration erhaltenen Signals) und einer guten chromatographischen Trennung von Ethylen (d. h. der Erzielung scharfer, gut definierter Peaks, die sich nicht mit anderen Headspace-Bestandteilen überlappen). für genaue und reproduzierbare Analysen erforderlich. Dieses Phänomen resultiert hauptsächlich aus den Bedingungen der Probeninjektion in das System (z. B. Injektionsvolumen, Durchflussrate, „Split“-Verhältnis der Verdünnung im GC-Injektor). Präzise δ13Cethylen-Messungen ermöglichen maximale Injektionsvolumina von ~ 1 ml und erfordern daher Proben, die hohe Ethylenkonzentrationen in ARAs (> 500 ppmv) ergeben. Zweitens weisen Acetylenmessungen (δ13C-Acetylen) aufgrund von Peaktailing und Memory-Effekten häufig große Unsicherheiten auf, was eine häufige Konditionierung der GC-Säule (d. h. eine kurze Temperaturerhöhung zur Entfernung von Wasser, Acetylen und anderen auf der Säule angesammelten Analyten) und Verbrennung erforderlich macht Reaktoroxidationen, bei denen reines O2 bei hoher Temperatur in den Reaktor gespült wird, um die Oxidationskapazität des Reaktors zu regenerieren. Schließlich werden die Messungen der Ethylen- und Acetylenisotope mithilfe von Methanisotopenstandards auf die internationale Kohlenstoffisotopenreferenzskala des VPDB kalibriert, da keine Ethylenstandards mit NIST-rückführbaren δ13C-Werten existieren. Abweichungen im chemischen Verhalten zwischen dem Methanstandard und den Zielanalyten Ethylen und Acetylen während der chromatographischen Trennung und Verbrennung können zu Verzerrungen bei der Driftkorrektur entlang und über mehrere Probenläufe hinweg führen, die aus Wiederholungsmessungen bestehen. Die klassische ISARA-Methode ist daher relativ zeitaufwändig und auf Proben mit hoher BNF-Aktivität beschränkt.

Analytische Methodik zur δ13C-Messung von Ethylen in einer Hintergrundmatrix, die 10 % v/v Acetylen oder kein Acetylen enthält, basierend auf (a) klassischen ISARA-Methoden mit Direktinjektion12, (b) dem EPCon-System, das Schritte zur Ethylenvorkonzentration und Acetylenentfernung hinzufügt, und (c) eine optionale chemische Fällung zur Entfernung von Acetylen34 vor dem Laden der Probe auf EPCon. Die EPCon-Entwicklung und der Schaltplan basieren auf Weigand et al.35. Abkürzungen: Ac – Acetylen.

Hier beschreiben wir eine hochempfindliche ISARA-Methode, die auf Proben mit geringer Stickstofffixierungsaktivität (ISARA mit geringer BNF-Aktivität, LISARA) abzielt. Es umfasst instrumentelle und methodische Verbesserungen der klassischen ISARA-Methode, die eine präzise Quantifizierung von Mo-unabhängigen BNF-Raten in Proben auf automatisierte Weise ermöglichen. Das neuartige Analysedesign basiert auf der Verbindung eines kommerziell erhältlichen GC-C-IRMS-Systems, das in traditionellen ISARA-Analysen verwendet wird, mit einem eigens hergestellten, vollautomatischen Online-Gas-Ethylen-Vorkonzentrationssystem (EPCon), das von Weigand et al.35 entwickelt wurde. Der EPCon entfernt Acetylen, einen Headspace-Bestandteil mit der größten Peakinterferenz mit Ethylen, und konzentriert Ethylen in Proben auf Werte, die hochpräzise Isotopenanalysen auf der Ebene von Teilen pro Million mit geringer analytischer Interferenz durch Nichtzielmoleküle ermöglichen. Bei dieser aktualisierten Methode wurden die ISARA-Probenanforderungen von etwa 500 ppmv Ethylen auf etwa 2 ppmv reduziert. Um kalibrierungsbasierte Unsicherheiten zu reduzieren, schlagen wir die Verwendung kommerziell erhältlicher und mikrobiell gewonnener interner Ethylenstandards vor, wodurch die Notwendigkeit von Acetylenmessungen entfällt und bessere Vergleiche innerhalb und zwischen Laboren ermöglicht werden. Um die Anwendbarkeit auf die Umwelt zu demonstrieren, verwenden wir LISARA, um BNF mit geringer Aktivität in holzfressenden Termiten sowie Laub-, Boden-, Moos-, Flechten- und verrotteten Holzproben aus Vorstadtwäldern im Nordosten der USA zu untersuchen. Die Ergebnisse deuten auf eine signifikante komplementäre BNF-Aktivität in verschiedenen Proben hin.

Nach dem Direktinjektionsansatz des klassischen ISARA12 mit einigen Modifikationen wurden ARA-Proben mit hoher Ethylenausbeute (> 500 ppmv) in 10 % v/v Acetylen manuell in einen Thermo Scientific Trace GC Ultra-Isolink mit einem Agilent HP-PLOT/ injiziert. Q-Kapillar-GC-Säule (30 m, Innendurchmesser = 0,32 mm, Fuß = 20 μm) und ein Verbrennungsreaktor, der mit einem Thermo Scientific Delta V Plus-Isotopenverhältnis-Massenspektrometer (GC-C-IRMS; Abb. 1a) verbunden ist. Zu den Modifikationen gehört der Ersatz von Silberferrulen im GC-Ofen durch Valcon-Polymid-Ferrulen (graphitverstärktes Polymer), um Memory-Effekte durch Acetylen zu begrenzen. Der Verbrennungsreaktor wurde vor jedem Lauf eine Stunde lang mit reinem Sauerstoff oxidiert, und zwischen den Messchargen wurden kurze (15-minütige) Keimoxidationen durchgeführt (d. h. alle ~ 6–8 Ethyleninjektionen, ~ 4–6 Acetyleninjektionen erforderlich), um die Reaktoroxidation zu regenerieren Kapazität und minimieren die Drift der δ13C-Werte. Weitere Geräteeinstellungen finden Sie online in der Ergänzungstabelle S1a.

ARA-Proben mit < 500 ppmv Ethylen wurden mit einem Ethylen-Vorkonzentrationssystem analysiert, das auf der Grundlage von Weigand et al.35 entwickelt und intern hergestellt wurde (EPCon, Abb. 1b). Das EPCon ist ein vollautomatisches Online-Gasaufbereitungssystem, das eine Reihe präzise getakteter Ventile, kryogene Fallen und einen Gaschromatographen (GC) verwendet, um Hintergrundkomponenten (insbesondere Wasser und Acetylen) zu entfernen und Ethylen zu konzentrieren, bevor es in das Gas eingeführt wird GC-C-IRMS. Das EPCon wurde durch Modifikation eines ähnlichen internen Systems entwickelt, das von Weigand et al.35 zur Messung von Stickstoff- und Sauerstoffisotopen in Meerwasser und Süßwassernitrat35,36,37 entwickelt und für die Messung von Ethylen in geringer Konzentration δ13C optimiert wurde. Zu den Unterschieden zum direkten Vorgänger35 gehört die direkte Verbindung zwischen Ventil 4 im EPCon („V4“ in Abb. 1) und der GC-Säule im kommerziellen GC-C-IRMS-System, wobei die Injektionskammer umgangen wird, um damit verbundene Probleme zu beseitigen (z. B. verminderte Empfindlichkeit, Peakverbreiterung). Durchflussraten, Drücke, Ventil- und Fallenzeiten wurden angepasst, um Ethylen und Acetylen effektiv zu trennen, sodass Acetylen aus dem Analytstrom entfernt werden konnte und Ethylen vor der Einführung in das GC-C-IRMS kryogen auf ein kleines Volumen konzentriert werden konnte. Ausführliche Informationen und Einstellungen zum Gerät finden Sie online unter „Ergänzende Methoden S1“ und „Ergänzende Tabelle S1b-c“.

Bei ISARA-Proben mit weniger als ~ 20 ppmv Ethylen war eine vollständige GC-Trennung von Acetylen und Ethylen innerhalb des EPCon-Systems unter unseren Laborarbeitsbedingungen aufgrund des extremen Massenungleichgewichts der Analyten nicht erreichbar. Vor der EPCon δ13Cethylen-Analyse dieser Proben führten wir eine Offline-Entfernung von Acetylen aus dem Proben-Kopfraum durch chemische Fällung von Acetylen mit Silbernitrat (AgNO3) in Ammoniak durch, wodurch ein Silbercarbidsalz34 entstand (chemische Fällung, Abb. 1c). Zu jeder Probe wurde ammoniakalische AgNO3-Lösung (0,5 g AgNO3 in 10 ml Wasser) hinzugefügt (0,5 ml AgNO3/10 ml Kopfraum mit 10 % Vol./Vol. Acetylen). Sobald die Reaktion abgeschlossen war (~ 10 Minuten), wurde der Probenkopfraum zur EPCon-Analyse in ein Autosamplerfläschchen überführt (Abb. 1b) und die verbleibende Carbidsalzlösung neutralisiert (1 ml 5 N HCl). Die vollständige Acetylenentfernung wurde durch Analyse auf einem Gaschromatographen mit Flammenionisationsdetektor (GC-FID) verifiziert. Wir haben den Einfluss der chemischen Ausfällung von Acetylen auf die δ13Cethylen-Werte anhand von Kontrollproben geschätzt, die mit 2000 ppmv Ethylen (aus Tank EY-4) ​​mit und ohne Zusatz von 10 % v/v Acetylen (n = 3, Tabelle 1) hergestellt wurden. Angesichts der hohen Reaktivität des Silbercarbidsalzprodukts der Fällung im trockenen Zustand muss die Acetylenfällung mit großer Sorgfalt gehandhabt werden34 und sie wurde in dieser Studie nur bei Bedarf durchgeführt (z. B. Probenethylen < 20 ppmv).

Um die Kontinuität zwischen unseren Probenanalysen innerhalb der Läufe und auf lange Sicht (zwischen den Läufen) sicherzustellen, verwendeten wir handelsübliche Ethylen- und Acetylengastanks als interne Tankstandards (Ethylen EY-4, EY-8, Acetylen AY-1, AY-4, Tabelle 1) zur Driftkorrektur und täglichen Qualitätssicherungskontrollen. Qualitätskontrollstandards zum Testen der IRMS- und EPCon-Leistung wurden vor jeder durchgeführten Probencharge analysiert. Alle δ13Cethylen-Messungen, die vom EPCon-GC-C-IRMS während langer Läufe (~ 30 Stunden) durchgeführt wurden, wurden hinsichtlich der zeitlichen Drift der Instrumentenreaktion im Vergleich zum Driftkorrekturstandard (EY-4) ​​korrigiert, der in gleichmäßigen Abständen während der Probenläufe gemessen wurde unter Verwendung linearer Interpolation zwischen Driftkorrekturstandards. Ein zweiter Standard (EY-8 oder eine separate Charge von EY-4-Standards) wurde verwendet, um den Driftkorrekturprozess unabhängig zu validieren. Daten aus Direktinjektionen wurden nach der von Zhang et al., 201612, beschriebenen klassischen Methode verarbeitet und erforderten aufgrund der häufigen Keimoxidationen des Reaktors keine Driftkorrektur. Einzelheiten zur Probenbeladung mit Platzierung der Qualitätskontrollstandards finden Sie in der Online-Ergänzungstabelle S2 und in den Online-Ergänzungsdaten S1 für Datenverarbeitungsberechnungen.

Für jede Messmethode (d. h. Direktinjektion, EPCon und chemische Fällung + EPCon) haben wir die Empfindlichkeit, die Bestimmungsgrenze, den Linearitätsbereich, die Wiederholbarkeit innerhalb eines Tages und die Reproduzierbarkeit innerhalb des Labors (wie in Carter und Barwick, 201138 definiert) durch wiederholte Messungen bestimmt Analyse des wichtigsten hauseigenen Ethylentankstandards (EY-4) ​​unter verschiedenen Bedingungen (Tabelle 1). Die Empfindlichkeit wurde durch lineare Regression des IRMS-Reaktionsmasse-44-Signals (Fläche in Voltsekunden [Vs]) relativ zur geladenen Menge an Ethylenkohlenstoff (C) (in nmol C) bestimmt. Der Linearitätsbereich wurde durch die niedrigsten und höchsten Mengen an Ethylen C definiert, die direkt in den GC injiziert oder in den EPCon-Autosampler geladen werden konnten, um eine Masse-44-Peak-Amplitude von 1–6 V zu erhalten (typischer konservativer Analysebereich). Die Proben wurden mit einem Ziel von ~ 2 V für das Masse-44-Signal geladen. Die Wiederholbarkeit (dh die Intraday-Variabilität) wurde als Durchschnitt der Standardabweichungen für jeden Tag über 26 Tage für die EPCon und 6 Tage für die Direktinjektion geschätzt. Die Reproduzierbarkeit im Labor wurde anhand der Standardabweichung der durchschnittlichen δ13C-Messungen für jeden Tag über 26 Tage für die EPCon und 6 Tage für die Direktinjektion berechnet.

Die Bestimmungsgrenze (LOQ) wurde basierend auf der minimalen Ethylenkonzentration (in ppmv) bestimmt, die mit jeder Methode gemessen werden konnte. Die technische LOQ, basierend auf Ethylenstandards und Proben ohne Acetylen, wird durch die minimal akzeptierte Peakamplitude (1 V für Masse 44) und die maximalen Ladevolumina für jede Methode (Direktinjektion, 1 ml, begrenzt durch Injektor und GC-Säule) begrenzt Beladung; EPCon- und chemische Fällungsmethoden, 20 ml, abhängig vom Volumen des Autosamplerfläschchens). Der methodische LOQ für Proben mit einer 10 %-Matrix, der durch das maximale Ladevolumen festgelegt wird, das eine Überlastung des Systems mit Acetylen vermeidet, beträgt 0,5 ml für Acetylen und 1,5 ml für EPCon. Der methodische LOQ bei Verwendung chemischer Fällung beträgt ~ 2 ppmv, die niedrigste Probenkonzentration, bevor die Hintergrund-Ethylenkonzentration, die in Acetylen übertragen wird, das aus Calciumcarbid erzeugt wird, größer ist als Ethylen aus der Acetylenreduktion der Probe.

Azotobacter vinelandii-Mutanten, die nur Mo-Nitrogenase („MoNase“-Mutante, Stamm CA70.139) oder nur V-Nitrogenase („VNase“-Mutante, Stamm CA11.7040) zur Stickstofffixierung verwendeten, wurden aerob bei 30 °C in einem modifizierten Burks-Medium gezüchtet12 ,41 mit 100 nM bis 1 µM NaMoO4 (Stamm CA70.1) oder NaVO3 (Stamm CA11.70). CA70.1 ist eine Mutante mit doppelter Gen-Deletion (ΔvnfDGK::spc, ΔanfHD70::kan), die nur die nif-Gene (Mo-Nitrogenase) exprimiert. CA11.70 ist ebenfalls eine Mutante mit doppelter Gen-Deletion (ΔnifHDK, ΔanfHD70::kan), die nur die vnf-Gene (V-Nitrogenase) exprimiert. Exponentielle Phasenzellen (OD620 nm ~ 0,3–0,8) wurden beprobt, um Acetylenreduktionstests zu starten. Weitere Informationen finden Sie online unter „Ergänzende Methoden S2“.

Überblick über die direkten Skalierungsmethoden für δ13Cethylen und 13εAR (= δ13C-Quelle Acetylen – δ13Cethylen) zur Umrechnung der δ13Cethylen-Werte der Probe in prozentuale Acetylenreduktion durch V-Nitrogenase (%VNase). Bei der direkten Skalierungsmethode 1 wird bei ARA-Inkubationen von Azotobacter-Mutanten, die nur Mo oder VNase exprimieren, dieselbe Charge Acetylenquelle wie für die Umweltproben verwendet, wodurch die Notwendigkeit entfällt, die Acetylenquelle δ13C zu messen, und die Berechnung des VNase-Prozentsatzes ausschließlich auf Basis von δ13Cethylen möglich ist . Gemäß den 13εAR-Skalierungsmethoden12 können verschiedene Chargen Acetylen für Proben- und einzelne Nitrogenase-Kalibrierungs-ARAs (z. B. Mutanten) verwendet werden; Gemessene (Methode 2) oder geschätzte (Methode 3) Werte von ẟ13C-Quelle Acetylen zusammen mit gemessenem δ13Cethylen für jede ARA-Charge werden zur Berechnung der 13εAR-Werte verwendet, die dann durch Vergleich mit 13εMo und 13εv in %VNase umgewandelt werden. Einzelheiten zur Gleichung finden Sie im Abschnitt „Methode“ oben und in den ergänzenden Methoden S5 online.

Natürliche Oberflächenproben (Moos, Cyanolichen, Laubstreu, Mutterboden, verrottendes Holz) und holzfressende Termiten mit geringer BNF-Aktivität wurden auf komplementäre Nitrogenase-Aktivität untersucht. Von 2019 bis 2021 wurden Proben an bewaldeten Standorten in Zentral-New Jersey (Institute of Advance Studies, Stony Ford Reserve, Pine Barrens, Watershed Institute) und New Hampshire (Mount Moosilauke) gesammelt. An jedem Standort wurden Dreifachproben jedes Probentyps entnommen eine oder mehrere Stationen (10 m × 10 m pro Station im Abstand von 500–1000 m). Bei Raumtemperatur gelagerte Proben wurden innerhalb von 5 Tagen nach der Entnahme von ARAs beurteilt. Holzfressende Termiten (Gattung Zootermopsis) wurden von Ward Scientific (https://www.wardsci.com) bezogen und vor der ARA 2–16 Tage lang in kontrollierten Laborlebensräumen gehalten. Weitere Informationen finden Sie online unter „Ergänzungsmethoden S3“ und „Ergänzungstabelle S3“.

Acetylenreduktionstests42 (ARAs) wurden an Azotobacter-Kulturen und Umweltproben unter Verwendung von 10 % v/v Acetylen, hergestellt aus Calciumcarbid, durchgeführt. Die Ethylenkonzentration im Kopfraum wurde mittels GC-FID überwacht. Einzelheiten zu ARA finden Sie online in den Ergänzungsmethoden S2, S3 und der Ergänzungstabelle S3.

Azotobacter-ARAs wurden bei 30 °C, 200–250 U/min unter Schütteln in 25–240 ml-Serumflaschen durchgeführt, die mit 20 mm blauen Butylstopfen (Bellco) verschlossen waren und 10 Vol.-% Zellkultur und eine anfängliche Headspace-Zusammensetzung von 90 Vol.-% enthielten. v Luft und 10 % v/v Acetylen. Headspace-Gas wurde in evakuierte Serumfläschchen (10 ml) mit 20 mm blauen Butylstopfen (Bellco) überführt, um es für eine spätere IRMS-Analyse aufzubewahren, sobald die Headspace-Ethylenkonzentrationen 100–2200 ppmv (MoNase-Stamm, typischerweise innerhalb von 4 Stunden nach der Inkubation) und 50 erreichten –200 ppmv (VNase-Stamm, innerhalb von 6 Stunden nach der Inkubation), was die hauseigenen Ethylen-Skalierungsstandards EY-Mo-1 und EY-V-1 ergibt (Tabelle 1, Abb. 2).

Feldproben-ARAs wurden in 100–500-ml-Einmachgläsern aus Glas (Mason, Ball) mit Metalldeckeln und 20 mm blauen Butylstopfen durchgeführt (Blattstreu, Erde und Holz, Ergänzungstabelle S3); in 30-ml-Glasfläschchen mit Schraubdeckel und PTFE/Silikon-Septa (Moos, Flechten, Erde, Ergänzungstabelle S3); oder in 15-ml-Serumfläschchen, verschlossen mit 20-mm-Butylstopfen (Termiten, Ergänzungstabelle S3). Kontrollinkubationen (ohne Acetylenzusatz) wurden mit Laubstreu, Erde, verrottendem Holz (Mt. Moosilauke, Pine Barrens), Moos und Flechten (Mt. Moosilauke) sowie Termitenproben durchgeführt, um die natürliche endogene Ethylenproduktion unabhängig von der Acetylenreduktion zu bewerten. Die ARA-Inkubationszeiten für Umweltproben variierten je nach Geschwindigkeit der Ethylenproduktion zwischen ~ 2 und 300 Stunden (Ergänzungstabelle S3), mit dem Ziel, mindestens 20 ppmv Ethylen zu erhalten. Die Probengewichte für ARA-Inkubationen schwankten aufgrund der Probenverfügbarkeit und der geschätzten Ethylenproduktionsrate und sind für jeden Standort und Probentyp in der Ergänzungstabelle S3 aufgeführt. Es wurden Teilproben aus dem ARA-Kopfraum entnommen (≤ 3 ml), um die Ethylenkonzentration mittels GC-FID zu messen, und der verbleibende Kopfraum wurde zur späteren Isotopenanalyse in evakuierte, versiegelte Fläschchen (10 ml) überführt.

Aufgrund der geringen BNF-Aktivität wurde δ13Cethylen um den Isotopeneinfluss von Hintergrundethylen (~ 2 ppmv) korrigiert, das durch 10 % v/v Quellacetylen in ARAs übertragen wurde (siehe ergänzende Methoden S4, Gleichung S1 online). Für ARA-Proben, die < 20 ppmv Ethylen produzierten, war eine Hintergrundkorrektur erforderlich; Aus Proben, die < 5 ppmv Ethylen produzieren, konnten aufgrund des isotopischen Einflusses des Hintergrundethylens keine quantitativen Informationen zur Nitrogenase abgeleitet werden. Für ARAs, die Ethylen > 5000 ppmv (d. h. 5 % der Acetylenkonzentration) liefern, wurde δ13Cethylen auch für die Rayleigh-Fraktionierung korrigiert12,43.

Eine von drei Methoden (Abb. 2) wurde verwendet, um den Beitrag der komplementären Nitrogenase zur Acetylenreduktion (als %VNase oder %FeNase) in ARAs unter Verwendung von δ13Cethylen und δ13Cacetylen zu quantifizieren. Die verwendete Skalierungsmethode hing davon ab, ob angesichts der Probenverfügbarkeit und technischer Schwierigkeiten bei der Chromatographie und Verbrennung präzise Messungen der δ13C-Acetylen-Quellenwerte erreichbar waren. Zur Messung von δ13Cethylen wurde EPCon-GC-IRMS verwendet. Alle δ13C-Acetylenmessungen wurden mit dem Direktinjektionsansatz durchgeführt. Ausführlichere Berechnungsdetails finden Sie online unter „Ergänzende Methoden S5“, „Ergänzende Tabelle S4“ und „Ergänzende Daten S1“.

Methode 1 – Der direkte Skalierungsansatz (Abb. 2), der die Notwendigkeit der Messung von δ13C-Acetylen umgeht, wurde zur Berechnung des komplementären Nitrogenase-Beitrags verwendet, wenn in Umweltproben-ARAs dieselbe Acetylenvorratsquelle wie in einem Satz von mit MoNase durchgeführten Kalibrierungs-ARAs verwendet wurde und VNase-Stämme von Azotobacter vinelandii. Gemessenes δ13Cethylen in Umgebungsproben-ARAs wird unter Verwendung von Endelement-δ13Cethylen-Werten (z. B. Ethylenskalierungsstandards, Tabelle 1, Abb. 2) in %VNase umgewandelt, um eine 0 % bzw. 100 % VNase-Aktivität zu diagnostizieren, die durch MoNase- und VNase-Azotobacter-Kalibrierungs-ARAs generiert wird ( Siehe ergänzende Methoden, S4, Gleichung S3 online). Einzelheiten zur Einrichtung und Analyse von Azotobacter-ARAs finden Sie online unter „Ergänzende Methoden S2“.

Wenn der in Proben-ARAs verwendete Quell-Acetylenbestand nicht in Azotobacter-Kalibrierungs-ARAs verarbeitet wurde, quantifizierten wir den komplementären Nitrogenase-Beitrag mithilfe klassischer ISARA-Ansätze12 (Abb. 2, Methoden 2 und 3), die Kenntnisse sowohl über δ13C-Acetylen als auch über δ13Cethylen der Probe erfordern, um die Isotopenvariation zu berücksichtigen in verschiedenen Acetylenvorräten bei Berechnungen von 13εAR (= δ13Cacetylen – δ13Cethylen).

Methode 2 – Das δ13C-Acetylen verschiedener in Proben und Azotobacter-ARAs verwendeter Acetylenvorräte, gemessen mit der Direktinjektionsmethode, wurde mit Proben-δ13Cethylen verwendet, um 13εAR zu berechnen, gefolgt von einer Kalibrierung auf die %VNase-Skala unter Verwendung von 13εV und 13εMo von Azotobacter und anderen Diazotrophen. Rhodopseudomonas palustris und Anabaena variabilis (Abb. 2, Ergänzende Methoden S5, Ergänzende Tabelle S4, Ergänzende Daten S1; Berechnung modifiziert nach Zhang et al., 201612).

Methode 3 – Als eine genaue Messung von δ13C-Acetylen durch Direkteinspritzung für den spezifischen Acetylenbestand innerhalb einer ARA nicht möglich war, verwendeten wir den Mittelwert und die Standardabweichung von δ13C-Acetylen für sieben verschiedene Chargen Acetylen, die in den letzten 4 Jahren aus Calciumcarbid erzeugt wurden (δ13C-Acetylen = 14,9 ± 0,9 ‰, n = 8; Ergänzende Abbildung S1; Gleichung S5) in 13εAR-Berechnungen. %VNase wurde unter Verwendung der 13εV- und 13εMo-Werte von Azotobacter und anderen Diazotrophen wie in Methode 2 berechnet (Abb. 2, Ergänzungsmethoden S5, Ergänzungstabelle S4, Ergänzungsdaten S1).

Das instabile Wachstum des Nur-Fe-Nitrogenase-Stamms A. vinelandii (RP1.1144, „FeNase“-Mutante) verhinderte die Berechnung von %FeNase auf Basis von Azotobacter. Berechnungen %FeNase (Abb. 2, Ergänzungsmethode S5, Tabelle S4, Daten S1) verwendeten EPCon abgeleitetes 13εFe = 5,2 ± 0,7‰ (sd) aus Rhodopseudomonas palustris unter Verwendung von nur FeNase12 in ARAs. Da 13εFe < 13εV < 13εMo12 ist, kann eine signifikante FeNase-Aktivität zu %VNase-Werten > 100 % führen (d. h. 100 % FeNase entspricht ~ 140 % VNase; Ergänzungstabelle S4). Die geschätzte Unsicherheit auf der %FeNase-Skala beträgt höchstens ~ 20 %.

Komplementäre Nitrogenase-Beiträge zur N2-Fixierung und Isoform-angepasste Gesamt-N2-Fixierungsraten können unter Verwendung des %VNase- oder %FeNase-Beitrags zu AR (siehe oben) und R-Verhältnissen berechnet werden, die die AR-zu-N2-Fixierungsrate für jede Nitrogenase angeben (z. B. RMoNase = 4, RVNase = 2, RFeNase = 0,5)12.

Die Messempfindlichkeit von δ13Cethylen durch GC-C-IRMS ist bei Zugabe des peripheren EPCon etwa 40-mal höher als bei Direktinjektion (4,3 vs. 0,1 Vs nmolC−1, Tabelle 1).

Durch Entfernen von Acetylen und Kondensieren von Ethylen vor der Einführung in die Säule in das GC-C-IRMS liefert das EPCon-GC-C-IRMS-System zuverlässige δ13Cethylen-Messungen mit nur 1,1 nmol C-Ethylen, während die Direktinjektionsmethode > 23,6 erfordert nmol C. Das größere zulässige Volumen des EPCon-Autosamplers (20 ml) im Vergleich zum GC-C-IRMS-Probeneinlassanschluss (≤ 1 ml) und die erhöhte Empfindlichkeit ermöglichen die Messung von Gasen mit ≥ 0,7 ppmv Ethylen in Abwesenheit von Acetylen im Hintergrund. Die minimale Ethylenkonzentration für Proben mit einem Hintergrund von 10 % v/v Acetylen (typische ARA-Proben) beträgt 9 ppmv oder 2 ppmv, wenn Hintergrundacetylen vor EPCon-Analysen durch chemische Fällung entfernt wird. Konservativ gesehen betragen die minimalen Arbeits-Ethylenkonzentrationen für ARA-Proben 500 ppmv (Direktinjektion), 20 ppmv (EPCon-GC-C-IRMS) und 5 ppmv (chemische Fällung + EPCon-GC-C-IRMS). Die geringere Empfindlichkeit der Direktinjektions-GC-C-IRMS-Methode ist teilweise auf die notwendige Verwendung eines hohen Teilungsverhältnisses innerhalb des Probeninjektoranschlusses zurückzuführen (40:1 – das Verhältnis von Proben- und He-Trägergasstrom, der aus dem Probeninjektoranschluss abgelassen wird). Injektionsöffnung im Verhältnis zu dem Anteil, der in die GC-Säule gelangt), um mit unserer Kapillar-GC-Säule die Peaks von Ethylen (~ einige bis mehrere hundert ppmv) und Acetylen (~ 100.000 ppmv) vollständig aufzulösen.

Wir verwendeten Tankethylen mit konstanten δ13C-Zusammensetzungen als interne Standards im Verlauf von ~ 30-Stunden-Läufen (~ 75 Proben und ~ 45 Qualitätskontrollen, typischer Laufaufbau in der Online-Ergänzungstabelle S2) für Driftkorrekturen innerhalb eines Tages (2–4 ‰ -Bereich; ergänzende Abbildung S3), verursacht durch Reaktoralterung im Laufe der Zeit (ohne häufige Keimoxidationen), wodurch die Vergleichbarkeit der Ergebnisse über mehrere Tage gewährleistet wird (langfristige Standardabweichung = 0,2‰, Tabelle 1). Wiederholbarkeit und laborinterne Reproduzierbarkeit von δ13Cethylen aus Tank EY-4 sind sowohl für die Direktinjektions- als auch für die EPCon-GC-C-IRMS-Methode ähnlich (Wiederholbarkeit 0,11‰ und 0,20‰; Reproduzierbarkeit 0,27‰ bzw. 0,17‰). Zusätzlich zur hohen Reproduzierbarkeit von δ13Cethylen aus dem EPCon-System stimmten die mit EPCon und Direktinjektionsmethoden erhaltenen δ13Cethylen-Werte für alle Ethylenstandards gut überein (Tabelle 1). Wir kommen zu dem Schluss, dass das EPCon-System keine wesentliche Verzerrung der Genauigkeit der Ergebnisse mit sich bringt und EPCon-Daten direkt mit veröffentlichten Ergebnissen vergleichbar sind, die mit Direktinjektionsmethoden erhalten wurden12,13,15,16.

Mithilfe von Tankstandards wurden mehrere Quellen für Unsicherheit und Verzerrungen bei δ13C-Messungen von Ethylen und Acetylen identifiziert. Zeitweise unterschätzte die von der Software vorgeschlagene automatische Integration den erwarteten δ13C-Wert des Standards, was wahrscheinlich auf einen erheblichen Rückstand von 13C im Vergleich zu 12C im Zusammenhang mit dem Verbrennungsreaktor zurückzuführen ist (ergänzende Abbildung S3). Dieses Phänomen war bei δ13C-Acetylenanalysen stärker ausgeprägt, möglicherweise aufgrund stärkerer Wechselwirkungen zwischen Acetylen und Verbrennungsreaktormetallen (CuO, NiO, Pt) sowie der GC-Säule selbst. Überschüssiges Acetylen (d. h. Spitzenamplitude der Masse 44 > 5 V), das während der δ13Cethylen-Analysen auftrat, verschärfte die Peak-Tailing-Probleme und führte zu einer verminderten δ13Cethylen-Präzision (um bis zu 5‰). Eine Überholung der GC-Säule und des Verbrennungsreaktors war erforderlich, wenn versehentlich überschüssiges Acetylen in das GC-C-IRMS gelangte (z. B. unvollständige Entlüftung innerhalb des EPCon).

Wir haben die Interferenzen verschiedener Gase, die häufig in Umweltproben vorkommen, und der während der ARA erzeugten Hintergrundgase getestet. Das EPCon-System entfernt erfolgreich die meisten Hintergrundgase (Luft/N2, CH4, CO2, Acetylen) und minimiert deren Spitzeninterferenzen mit Ethylen (Tabelle 1). Nur Ethan, das mit < 3 % der Ethylenase in ARAs12,14 produziert wird, wird vom EPCon zurückgehalten, aber seine Isotopeninterferenz mit Ethylen ist minimal, da Ethan- und Ethylenpeaks im GC-C-IRMS gut getrennt sind .

Die Messung von δ13Cethylen durch EPCon-GC-C-IRMS und δ13C-Acetylen durch Direktinjektions-GC-C-IRMS für Proben-ARAs bildet die Grundlage der Low BNF Activity Isotopic Acetylene Reduction Assay-Methode (LISARA). Wir haben LISARA auf verschiedene Umweltproben (Boden, Laubstreu, verrottetes Holz, Moos und Cyanolichen von Standorten im Nordosten der USA sowie im Labor gezüchtete holzfressende Termiten) mit einem breiten Spektrum an Ethylenausbeuten in ARAs (5–1000 ppmv) angewendet. . Eine (oder mehrere) von drei Berechnungsmethoden (Abb. 2) wurden verwendet, um den %VNase- (oder %FeNase-)Beitrag zur Acetylenreduktion (AR; Methoden 1, 2, 3, Abb. 2 und 3) zu ermitteln.

Die klassische ISARA-Methode12 verwendet zur Bestimmung 13εAR, die kohlenstoffstabile Isotopenfraktionierung aufgrund der Acetylenreduktion in ARAs (d. h. δ13Cacetylen–δ13Cethylen) und diagnostische 13εAR-Werte für AR durch jede Nitrogenase-Isoform (13εMo, 13εV und 13εFe, Ergänzungstabelle S4). %VNase oder %FeNase (Abb. 2 und 3). Um die Acetylen-δ13C-Messung zu umgehen, die typische Unsicherheiten aufweist, die drei- bis viermal höher sind als die von Ethylen (Tabelle 1) und häufig im System verbleibt, was eine häufige GC-C-Rekonditionierung erforderlich macht, haben wir einen direkten Skalierungsansatz entwickelt, um den komplementären Nitrogenase-Beitrag allein auf dieser Grundlage zu berechnen auf δ13Cethylen (Abb. 2, Methode 1). Dies wird durch den Vergleich von δ13Cethylen erreicht, das aus einer gemeinsamen Acetylenquelle erzeugt wird, die in Umweltproben-ARAs (δ13Csample) verwendet wird, und Sätzen von Isotopenkalibrierungs-ARAs, die mit MoNase- und VNase-Stämmen von Azotobacter vinelandii (δ13CMo und δ13CV, Abb. 2, Ergänzende Methoden S5) durchgeführt wurden. . Wir konnten die δ13CFe-Werte für %FeNase-Berechnungen mit A. vinelandii durch direkte Skalierungsansätze nicht bestimmen, da das Wachstum des FeNase-Stamms RP1.1144 instabil war.

Im Idealfall würden die Isotopenwerte aller Proben mit Methode 1, dem direkten Skalierungsansatz, auf % komplementäre Nitrogenase skaliert, da dieser mit der geringsten Unsicherheit verbunden ist. Die Methoden 2 und 3 werden auf Proben angewendet, die analysiert wurden, bevor Standards für die direkte Skalierung und zugehörige Protokolle entwickelt wurden. Sie können auch in Fällen verwendet werden, in denen direkte Skalierungsverfahren nicht abgeschlossen werden konnten (z. B. unzureichendes Acetylen, fehlgeschlagene Azotobacter ARA-Experimente). Während Methode 3 mit der höchsten Unsicherheit verbunden ist, bietet sie die schnellste Möglichkeit, den Beitrag komplementärer Nitrogenasen zu BNF abzuschätzen.

Mit Ausnahme von Cyanolichenen zeigten alle Probentypen ein Isotopensignal, das mit der komplementären Nitrogenase-Aktivität übereinstimmt (Abb. 3, zusammenfassende Statistik in der Legende, beachten Sie, dass 140 % VNase 100 % FeNase entspricht, siehe Methoden oben). Mögliche Beiträge der komplementären Nitrogenase zur AR in Laubstreu- und Moosproben lagen zwischen 0 und 100 % VNase, mit Ausnahme einer Laubstreuprobe mit 195 % VNase. Mögliche Beiträge durch verrottendes Holz und Termiten lagen zwischen 40 und 160 % VNase. Auch die Bodendaten schwanken stark und liegen zwischen 30 und 180 % VNase. Einige der 114 analysierten Proben sind Ausreißer mit mehr als ~ 200 % VNase (1 Moos, 2 Bodenproben, Daten in Abb. 3 nicht dargestellt), was wir auf die Isotopenfraktionierung des Gases aufgrund von Stopfenlecks zurückführen.

Die geschätzte Unsicherheit für %VNase-Beiträge zur AR für Umweltproben, die durch direkte Skalierung von δ13Cethylen-Werten quantifiziert werden, ist geringer als die Unsicherheiten von 13εAR-basierten Methoden: ~ 9 % für direkte Skalierungsmethode 1, ~ 15 % für 13εAR-Methode 2, ~ 20 % für 13εAR Methode 3 (Abb. 3, Ergänzungsmethode S5; Ergänzungsdaten S1). Die erhöhte Präzision, die durch die direkte Skalierung von δ13Cethylen auf %VNase (Methode 1) erzielt wird, vermeidet die mit δ13C-Acetylenmessungen verbundene Unsicherheit. Dies wird in Abb. 3 deutlich, wo %VNase-Werte für die einzelnen Nitrogenase-Mutanten (d. h. Werte für Av MoNase und Av VNase in Abb. 3) für Methode 1 (verwendet direkte Skalierung der Proben- und Mutanten-δ13Cethylen-Werte) enger gebündelt sind ) als die für die Methoden 2 und 3 (verwendet explizite 13εAR-Werte). Die meisten komplementären Nitrogenase-Zuordnungen für Einzel-Nitrogenase-Kultur-ARAs liegen innerhalb von 15 % ihrer erwarteten Werte (d. h. 0 % VNase für den MoNase-Stamm A. vinelandii, 100 % VNase für den VNase-Stamm A. vinelandii, 100 % FeNase = 140 % VNase für R. palustris FeNase-Stamm), jedoch weisen einige Proben ~ 20–30 % Fehler auf (z. B. ~ 130 % VNase für den A. vinelandii VNase-Stamm, ~ − 20 % VNase für den A. vinelandii MoNase-Stamm). Die Unsicherheiten für %FeNase, quantifiziert mit 13εAR und 13εFe aus Rhodopseudomonas palustris FeNase, betragen ~ 15–20 % (Ergänzungsmethode S6, Ergänzungsdaten S1). Daher sollten Proben, die höchste Präzision (sehr niedrige BNF-Aktivität) für die Quantifizierung des komplementären Nitrogenase-Beitrags erfordern, die auf δ13Cethylen basierende direkte Skalierungsmethode (Methode 1) verwenden.

Komplementärer Nitrogenase-Beitrag zur Acetylenreduktion (als %VNase oder %FeNase) in ARAs an Umweltproben mit geringer BNF-Aktivität und einzelner Nitrogenase unter Verwendung diazotropher Kulturen. Probenzusammenfassungsstatistik (Durchschnitt ± SD %VNase, Bereich %VNase, Anzahl Proben): Laubstreu (32,4 % ± 45,4 %, − 19,9 bis 195,4 %, 30), Flechten (− 0,8 % ± 4,7 %, − 8,9 bis 5,6). %, 6), Moos (65,3 % ± 37,9 %, − 14,5 bis 123,0 %, 31), Boden (123,9 % ± 37,2 %, 25,4 bis 177,8 %, 21), Termiten (130,1 % ± 22,0 %, 104,8 bis 156,6 % , 7) und Verrottendes Holz (125,9 % ± 32,6 %, 40,6 bis 167,6 %, 43). Die Abkürzungen lauten wie folgt: Av MoNase – Azotobacter vinelandii MoNase-Stamm, Av VNase – A. vinelandii VNase-Stamm und Rp FeNase – Rhodopseudomonas palustris FeNase-Stamm. Einzelheiten zu Skalierungs- und Unsicherheitsberechnungen finden Sie online in den Ergänzungsmethoden S5 und S6 sowie in den Ergänzungsdaten S1.

Angesichts der Unsicherheiten müssen ARA-Proben mit > 160 % auf der %VNase-Skala und > 120 % auf der %FeNase-Skala stark von Prozessen beeinflusst werden, die nichts mit BNF zu tun haben (z. B. natürlicher endogener Ethylenkreislauf – Produktion oder Verbrauch, Gasleckage aus Stopfen). Eine nicht mit BNF in Zusammenhang stehende Fraktionierung könnte die > 160 % VNase-Werte erklären, die für bestimmte Abfallproben (n = 1), Moos (n = 1), Erde (n = 4) und verrottetes Holz (n = 2) beobachtet wurden.

Die erhöhte Empfindlichkeit des EPCon-GC-C-IRMS-Systems im Vergleich zum GC-C-IRMS (Tabelle 1) führt zu einem ca. 120–450-fach geringeren Bedarf an Probenethylen (abhängig davon, ob auch Acetylen in der Probe vorhanden ist, Tabelle 1). Wichtig ist, dass EPCon-Analysen von ARA-Proben dazu führen, dass die GC-Säule und der Verbrennungsreaktor nur begrenzt dem Acetylen in ARA-Proben ausgesetzt sind, was aufgrund der Verschlechterung der Leistung der GC-Säule und des Reaktors durch Acetylen zu einer erheblichen Abweichung der Analyseergebnisse führt. In Kombination mit Driftkorrekturen innerhalb eines Tages auf der Grundlage von Tankgas mit konstantem δ13C führt die Verwendung des EPCon-Systems zu reproduzierbareren Ergebnissen, begrenzt die Anzahl der Reaktoroxidationen und verlängert die Lebensdauer des Reaktors und der Kapillar-GC-Säule, wodurch Zeit und Zeit verkürzt werden -Termkosten pro IRMS-Analyse. Darüber hinaus gewährleisten alle diese instrumentellen und analytischen Verbesserungen vergleichbare Ergebnisse mit viel niedrigeren Ethylenkonzentrationen über Analyseläufe und Experimente hinweg, ohne die Reproduzierbarkeit zu beeinträchtigen. Dadurch können 120 Messungen von δ13Cethylen automatisiert über einen 30-stündigen Lauf im EPCon-System durchgeführt werden, verglichen mit 7–10 Tagen Vollzeitarbeit für eine Person bei direkter Injektion in das GC-C-IRMS.

Die LISARA-Methode ist eine wichtige analytische Verbesserung, die für Studien zur Stickstofffixierung durch komplementäre Nitrogenasen in der globalen Umwelt notwendig ist. Das analytische Upgrade EPCon-GC-C-IRMS ermöglicht die zuverlässige und reproduzierbare Isotopencharakterisierung von Ethylen in ARA-Proben bei praktisch jeder Ethylenkonzentration. In der Praxis können routinemäßig Proben mit nur 20 ppmv Ethylen gemessen werden, bevor die Fähigkeit zur Acetylenentfernung durch den EPCon erreicht ist (Abb. 1). ARA-Proben mit sehr geringer Ausbeute (5–20 ppmv Ethylen) können auch mit dem EPCon-System gemessen werden, nachdem Acetylen mithilfe chemischer Fällung vollständig aus dem Kopfraum entfernt wurde (siehe Abschnitt „Methoden“). Das Vorhandensein von Hintergrund-Ethylen, das in für ARAs verwendetes Acetylen übertragen wird, und eine potenzielle natürliche endogene Ethylenproduktion (d. h. nicht mit BNF assoziiert) können jedoch die δ13Cethylen-Werte beeinflussen und die Interpretation des komplementären Nitrogenase-Beitrags in Proben mit sehr geringer BNF-Aktivität, die mit LISARA bewertet wurden, erschweren.

Die Entwicklung eines direkten Skalierungsansatzes zur Berechnung komplementärer Nitrogenase-Beiträge, die ausschließlich auf δ13Cethylen aus LISARA-Analysen basieren, umgeht mehrere Einschränkungen, die mit herkömmlichen ISARA-Analysen verbunden sind, wie z. B. die Notwendigkeit von Ethylenkonzentrationen > 500 ppmv und die Notwendigkeit von δ13C-Acetylenmessungen. Darüber hinaus würde der Offline-Fällungsschritt zur vollständigen Entfernung von Acetylen aus dem Kopfraum der ARA-Probe es jedem Mikrobiologie- oder Nasschemielabor ermöglichen, ISARA-Analysen von Ethylen aus Proben und einzelnen Nitrogenase-Kalibrierungs-ARAs, die mit derselben Acetylenquelle durchgeführt werden, an andere Laboratorien für die Analyse stabiler Isotope für δ13Cethylen auszulagern Messungen. Wir weisen darauf hin, dass die Vergleichbarkeit der absoluten δ13C-Werte zwischen Forschungsgruppen variieren und schwer zu beurteilen sein kann, da mehrere Faktoren (z. B. der Typ der GC-Säule und der Zustand des Oxidationsreaktors) die absoluten δ13C-Werte beeinflussen können. Daher ist die gleichzeitige Analyse einzelner Nitrogenase-Kalibrierungs-ARAs und Umweltproben besonders wichtig.

Neben Studien zur komplementären Nitrogenase findet das EPCon-System auch in anderen Bereichen, einschließlich der Pflanzenbiologie, Anwendung. Beispielsweise könnte eine EPCon-Analyse der Isotopenzusammensetzung von endogen produziertem Ethylen (z. B. von Bodenbakterien und Pflanzen), einem Phytohormon, das an Stressreaktionen und der Samenkeimung beteiligt ist,45 dabei helfen, seine Quellen zu identifizieren und seinen Kreislauf in komplexen Bodenumgebungen zu verfolgen.

Von den verschiedenen terrestrischen Proben, die mit LISARA charakterisiert wurden, wiesen 5 der 6 Probentypen δ13Cethylen-Werte auf, was mit einem gewissen Beitrag der komplementären Nitrogenase zur BNF-Aktivität übereinstimmt (Abb. 3). Diese Ergebnisse tragen zu den wachsenden Beweisen bei, die auf eine weit verbreitete komplementäre Nitrogenase-Aktivität in terrestrischen Ökosystemen hinweisen. Im Gegensatz zu einer früheren Studie zur Cyanolichen-Art Peltigera in borealen Wäldern, die ein hohes Maß an komplementärer Nitrogenase-Aktivität13 ergab, fanden wir in Proben derselben Gattung, die im gemäßigten Nordosten der USA gesammelt wurden, keine Hinweise auf VNase-Aktivität (Abb. 3, Flechten). Es wurde festgestellt, dass die komplementäre Nitrogenase-Aktivität in dieser Cyanolichen-Gattung hauptsächlich durch die Menge an Molybdän in Flechten-Thalli (Mo-Thalli-Gehalt < 300 µgMo.gdry_lichen−1)13 gesteuert wird, was die atmosphärische Ablagerung widerspiegelt. Die höhere atmosphärische Ablagerungsrate von Mo im gemäßigten Nordosten der USA46 könnte diesen Flechtenproben ausreichend Mo liefern, um den Bedarf an komplementärer Nitrogenase-BNF zu vermeiden.

Die hier beobachtete konsistente komplementäre Nitrogenase-Aktivität für nordöstliche Laubstreu, Boden, verrottende Holzproben und für holzfressende Termiten spiegelt wahrscheinlich andere und komplexere Mo-Kontrollen bei BNF wider als bei Cyanolichenen und Moosen, die direkter mit der Mo-reichen atmosphärischen Ablagerung zusammenhängen . Es bestehen wahrscheinlich Unterschiede im Mo-Bedarf zwischen Diazotrophen, was möglicherweise auf Unterschiede in den Metallmanagementstrategien auf Organismenebene47 und in den physikalisch-chemischen Eigenschaften der Umgebung von Diazotrophzellen zurückzuführen ist, die die Mo-Bioverfügbarkeit modulieren können. Beispielsweise könnten höhere Konzentrationen bestimmter Formen organischer Substanz mit starker Mo-Bindungskapazität (Katecholeinheiten) in Proben48 zu einem höheren Gesamt-Mo-Bedarf für Mo-BNF führen, was die Beziehungen zwischen Mo und komplementärer Nitrogenase in den Proben beeinflusst49. Insgesamt unterstreichen unsere Ergebnisse die Notwendigkeit detaillierterer Studien zu komplementärem BNF und seinen Kontrollen in vielen gängigen Probentypen.

Das Vorhandensein von Hintergrundethylen im Ausgangsacetylen (~ 2 ppmv Ethylen pro 10 % v/v Acetylen aus Calciumcarbid) bleibt eine Herausforderung bei der Quantifizierung komplementärer Nitrogenase in Umweltproben mit sehr geringer Aktivität (< 20 ppmv Ethylen, erzeugt in ARAs). Während das Isotopensignal des Hintergrundethylens im Ausgangsacetylen mit den vorliegenden EPCon-Methoden leicht bestimmt werden kann, gibt es erhebliche Schwankungen (8,4 ± 1,9‰, n = 8 Acetylenchargen). Isotopenkorrekturen für das Hintergrundethylen führen bei ARAs mit einer Ethylenausbeute von 10–20 ppmv nicht zu einem großen Verlust an Präzision und Genauigkeit, würden jedoch bei Proben mit Ethylen < 10 ppmv zu einem starken Anstieg der Unsicherheit führen. Daher kann die LISARA-Methode nur qualitative Informationen zur komplementären Nitrogenase für Proben mit 2–5 ppmv Ethylen liefern.

Bei der Untersuchung von Umweltproben kann der natürliche Kreislauf von endogenem Ethylen durch Bodenbakterien und Pflanzen auch die Quantifizierung des komplementären Nitrogenase-Beitrags beeinträchtigen (siehe Hendrickson 198950 und die darin enthaltenen Referenzen). Da sauerstoffarme Bedingungen die Ethylenproduktion begünstigen und die Ethylenoxidation hemmen50, verstärken lange Inkubationen dieses Phänomen wahrscheinlich. In dieser Studie beobachteten wir eine signifikante endogene Produktion von Ethylen (d. h. > 5 % der ARA-produzierten Ethylenkonzentration für einen bestimmten Probentyp und -ort) in 12 von 93 Kontrollproben, denen kein Acetylen zugesetzt wurde. Alle 12 Proben, die endogenes Ethylen enthielten, wurden 290 bis 300 Stunden lang inkubiert (27 Proben wurden so lange inkubiert). Eine weitere Charge von 27 Proben, die 165 bis 175 Stunden lang inkubiert wurden, zeigte keine Anzeichen einer endogenen Ethylenproduktion. Es wurde berichtet, dass Acetylen die Ethylenoxidation hemmt. Daher sind Kontrollproben, denen kein Acetylen zugesetzt wurde, möglicherweise nicht ausreichend, um die endogene Ethylenproduktion in ARAs mit sehr geringer Ethylenausbeute (< 20 ppmv) zu beurteilen50. Wir empfehlen daher, die Proben bei der Durchführung einer ISARA- oder LISARA-Untersuchung idealerweise weniger als 60 Stunden lang zu inkubieren. Insgesamt deuten die niedrige endogene Ethylenproduktionsrate unserer Proben während der Inkubationen (Ergänzungstabelle S3) und die Ähnlichkeit der Isotopensignaturen, die für jeden Probentyp über vier Standorte, 2 Jahre und verschiedene Inkubationszeiten (2–300 Stunden) erhalten wurden, darauf hin, dass dies natürlich ist Der Ethylenkreislauf hat nur minimalen Einfluss auf unsere berichteten Ergebnisse.

Unser aktualisiertes Analyseverfahren und unsere aktualisierte Methodik ermöglichen nun die Untersuchung des Beitrags und der Umweltkontrollen der komplementären Nitrogenase in den meisten N2-fixierenden Proben, ungeachtet der verbleibenden Einschränkungen bei der LISARA-Analyse von Ethylenproben mit sehr geringer Ausbeute aus ARA. Die LISARA-Methode verringert die mit Acetylenmessungen verbundene Unsicherheit und Verzerrung und ermöglicht den breiteren Einsatz der ISARA-Methode bei Reinkulturen und Organismen mit hoher Ausbeute. Schließlich liefert unsere Untersuchung gängiger Probentypen in mehreren gemäßigten Ökosystemen im Nordosten der USA weitere Belege für die ökologische Bedeutung der komplementären Nitrogenase für den Kreislauf von Stickstoff und Spurenmetallen in terrestrischen Ökosystemen. Probenspezifische Unterschiede im Beitrag, wie unsere Ergebnisse nahelegen, erfordern weitere Untersuchungen zu den Kontrollen der isozymspezifischen Nitrogenase in natürlichen Umgebungen.

Alle hier präsentierten Daten finden Sie online in den Zusatzinformationen 1 (einschließlich Methoden S1–S6; Abbildungen S1–S3; Tabellen S1–S5) und Zusatzdaten S1.

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Wir danken dem Watershed Institute (https://thewatershed.org), der Carbon Mitigation Initiative (Princeton High Meadows Environmental Institute an XZ), dem Tuttle Fund (Princeton Geoscience Department an XZ) und dem NSF EAR Grant 1631814 (an XZ) und ein Simons Foundation Life Science Research Postdoctoral Fellowship (an RD). Wir danken den Mitarbeitern am Watershed Institute, der Rutgers Pineland Field Station, dem Stony Ford Center for Ecological Studies an der Princeton University, dem Institute of Advanced Studies und dem Dartmouth College-Mt. Moosilauke-Beratungsausschuss für Erlaubnis und Zugang zu Feldproben; Katja Luxem und Linta Reji für ihre Hilfe bei der Feldarbeit, Anne Kraepiel, F. Morel, JP Bellenger und alle Mitglieder des Zhang-Labors für Diskussionen.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Shannon J. Haynes und Romain Darnajoux.

Fachbereich Geowissenschaften, Princeton University, Guyot Hall, Princeton, NJ, 08544, USA

Shannon J. Haynes, Romain Darnajoux, Eunah Han, Sergey Oleynik und Xinning Zhang

High Meadow Environmental Institute, Princeton University, Guyot Hall, Princeton, NJ, 08544, USA

Ezra Zimble & Xinning Zhang

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SJH, RD und XZ haben den Manuskripttext geschrieben. SJH und RD haben die Zahlen erstellt. SO hat das in dieser Studie verwendete EPCon-Instrument gebaut. SH leitete die methodische Entwicklung mit Beiträgen von RD, SO und XZ, SJH, RD, EH und EZ sammelten Feldproben und trugen zur Datenerfassung bei. SJH, RD und EH führten eine Datenanalyse durch. XZ stellte technisches Fachwissen, Projektberatung und finanzielle Unterstützung bereit. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Shannon J. Haynes oder Xinning Zhang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Haynes, SJ, Darnajoux, R., Han, E. et al. Quantifizierung der biologischen Stickstofffixierung durch Mo-unabhängige komplementäre Nitrogenasen in Umweltproben mit geringer Stickstofffixierungsaktivität. Sci Rep 12, 22011 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24860-9

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Eingegangen: 22. August 2022

Angenommen: 22. November 2022

Veröffentlicht: 20. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24860-9

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