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Nov 29, 2023

ADAMTSL3-Knockdown

Band Kommunikationsbiologie

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 1392 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Herzinsuffizienz ist weltweit eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität und kann aus einer Drucküberlastung resultieren, bei der der Umbau des Herzens durch Kardiomyozytenhypertrophie und -tod, Fibrose und Entzündung gekennzeichnet ist. Bei Herzinsuffizienz treibt der transformierende Wachstumsfaktor (TGF)β die Differenzierung von Herzfibroblasten (CFB) zu Myofibroblasten voran, was zu einer übermäßigen Produktion extrazellulärer Matrix und kardialem Umbau führt. Es sind neue Strategien zur Bekämpfung der pathologischen TGFβ-Signalübertragung bei Herzinsuffizienz erforderlich. Hier zeigen wir, dass das sekretierte Glykoprotein ADAMTSL3 TGFβ im Herzen reguliert. Wir fanden heraus, dass Adamtsl3-Knockout-Mäuse eine verschlimmerte Herzfunktionsstörung und -dilatation mit erhöhter Mortalität entwickeln und dass Herzen nach Drucküberlastung durch Aortenbandbildung eine erhöhte TGFβ-Aktivität und CFB-Aktivierung aufweisen. Darüber hinaus hemmt die Überexpression von ADAMTSL3 in kultivierten CFBs die TGFβ-Signalübertragung, die Myofibroblastendifferenzierung und die Kollagensynthese, was auf eine kardioprotektive Rolle von ADAMTSL3 durch die Regulierung der TGFβ-Aktivität und des CFB-Phänotyps schließen lässt. Diese Ergebnisse rechtfertigen eine zukünftige Untersuchung der möglichen positiven Wirkung von ADAMTSL3 bei Herzinsuffizienz.

Herzinsuffizienz ist weltweit eine der Hauptursachen für Morbidität, Krankenhausaufenthalte und Mortalität und betrifft 2–3 % der Bevölkerung1. Bei Drucküberlastung kommt es zu einer Umgestaltung des Myokards mit typischen pathophysiologischen Reaktionen, einschließlich Kardiomyozyten-Hypertrophie und -Tod, Fibrose und Entzündung, wobei hypertrophes Wachstum häufig einer erweiterten Herzinsuffizienz vorausgeht2.

Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist für die Aufrechterhaltung der strukturellen und funktionellen Integrität des Herzens von entscheidender Bedeutung, und Herzfibroblasten (CFBs) sind die Hauptproduzenten der ECM im Herzen3. Bei Herzinsuffizienz werden CFBs aktiviert und differenzieren sich in stark proliferierende und ECM-produzierende Myofibroblasten3,4, die durch eine starke Expression von α-Smooth-Muscle-Actin (α-SMA)5,6 gekennzeichnet sind. Dieser Prozess ist für die Wundheilung von entscheidender Bedeutung. Eine übermäßige CFB-Aktivierung führt jedoch zu einem pathologischen Umbau des Herzens durch Aktivierung von Wachstumsfaktoren, Entzündungen, verringerter elektrischer Leitfähigkeit und erhöhter Myokardsteifheit, was auf eine erhöhte Kollagenablagerung und -vernetzung bei Herzfibrose zurückzuführen ist3,7. Der transformierende Wachstumsfaktor (TGF)β ist für die CFB-Aktivierung erforderlich5 und stellt ein attraktives therapeutisches Ziel bei Herzinsuffizienz dar8. Die direkte TGFβ-Hemmung wird jedoch durch Off-Target-Effekte begrenzt9,10 und ein besseres Verständnis der TGFβ-vermittelten CFB-Aktivierung im Herzen ist erforderlich, um die Ergebnisse bei Herzinsuffizienz zu verbessern.

Matrizelluläre Proteine ​​sind dynamisch exprimierte, nichtstrukturelle, regulatorische Moleküle im kardialen ECM7. Wir haben kürzlich festgestellt, dass eine siebenköpfige Familie matrizellulärer Proteine, die eine Desintegrin-ähnliche und Metalloprotease-Domäne mit Thrombospondin-Typ-1-Motiv-ähnlichen (ADAMTSL) Proteine, bei experimenteller und klinischer Herzinsuffizienz hochreguliert ist11. ADAMTSLs sind strukturell mit den ADAMTS-ECM-Proteasen verwandt12, ihnen fehlt jedoch eine katalytische Domäne, sodass ihre biologische Funktion weitgehend unbekannt ist. Immer mehr Hinweise deuten auf eine Rolle bei der TGFβ-Regulation hin, da mehrere ADAMTSLs Fibrillin-Mikrofibrillen und das latente TGFβ-Bindungsprotein (LTBP)1 binden und regulieren, die TGFβ im ECM binden13,14. Varianten in ADAMTSL-Genen phänokopieren Fibrillinopathien mit fehlregulierter TGFβ-Signalübertragung als konsistentes molekulares Merkmal11,15,16,17.

Hier berichten wir über die Erzeugung und Charakterisierung einer Maus mit gezielter Inaktivierung von Adamtsl3 (L3-KO), mit der wir ADAMTSL3 im drucküberlasteten Herzen untersuchten. Wir fanden heraus, dass L3-KO-Mäuse nach einer durch Aortenbandbildung (AB) verursachten Drucküberlastung eine Herzfunktionsstörung und -dilatation mit höherer Mortalität sowie eine erhöhte TGFβ-Aktivität und CFB-Aktivierung entwickeln. Die Überexpression von ADAMTSL3 in kultivierten menschlichen CFBs hemmte die TGFβ-Aktivität und die Myofibroblastenumwandlung, was zu einer verringerten ECM-Expression und Kollagensynthese führte.

Die ADAMTSL3-Expression war in LVs von Patienten mit Aortenstenose (AS; Abb. 1a) um das Zweifache hochreguliert, und im Myokard von Patienten mit ischämischer DCM (iDCM) waren ADAMTSL3-mRNA und -Protein um das 1,5-fache hochreguliert (Abb. 1b-c). ). Zu den Patientenmerkmalen wurde bereits früher berichtet: Patienten mit symptomatischer AS mit LV-Hypertrophie, Fibrose und Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion (HFpEF)18 oder DCM im Endstadium mit Fibrose und dilatativer Herzinsuffizienz mit reduzierter Ejektionsfraktion (HFrEF)19. In ähnlicher Weise war die Adamtsl3-Expression in LVs von WT-Mäusen, die einer kürzlich beschriebenen AB-Prozedur für eine oder sechs Wochen unter Verwendung von O-Ringen mit festem Durchmesser unterzogen wurden, um das Zwei- bis Dreifache erhöht (Abb. 1d). Die ADAMTSL3-Proteinspiegel wurden aufgrund des Mangels an funktionierenden Antikörpern bei Mäusen nicht untersucht (Abb. S1a-b).

ab ADAMTSL3/RPL32-mRNA-Spiegel in linksventrikulären (LV) Biopsien von Patienten mit einer Aortenstenose (AS, n = 11) und b ischämischer dilatativer Kardiomyopathie (iDCM, n = 9) im Vergleich zu entsprechenden Kontrollen. c Western Blot und Quantifizierung der ADAMTSL3-Protein-/Gesamtproteinspiegel in LVs von Patienten mit iDCM (n = 8) im Vergleich zu Kontrollen (n = 7). d Adamtsl3/Rpl32-mRNA-Spiegel in LVs von Wildtyp-Mäusen (WT) 1 und 6 Wochen nach Aortenbandbildung (AB) oder Scheinoperation (n = 5 Scheinoperationen und n = 7 AB nach 1 Woche, n = 8 Scheinoperationen und n = 12 AB nach 6 Wochen). e In-situ-Hybridisierung von Adamtsl3-mRNA (rote Färbung) im linken Vorhof von AB- und scheinoperierten Mäusen und in der LV-Wand von AB-Mäusen, 4 Wochen nach AB, mit Hämatoxylin-Kerngegenfärbung (lila). f RNA-Sequenzierungsdaten aus dem Projektportal Genotype-Tissue Expression (GTEx). In GTEx stellen insgesamt 17.382 Proben aus 54 nicht erkrankten Geweben von 948 verstorbenen menschlichen Organspendern eine Kontrollpopulation dar. Die Spender sind 20–70 Jahre alt, 33 % weiblich, 85 % Weiße und 13 % Afroamerikaner. Die ADAMTSL3-Expression wird als Transkripte pro Kilobase Million (TPM) in LV (n = 432, mittlerer TPM = 2,54) und im linken Vorhofohr (LAA, n = 429, mittlerer TPM = 9,66) angezeigt. g-mRNA-Spiegel von Adamtsl3 in Herzfibroblasten (nrCFB) und Kardiomyozyten (nrCM) neugeborener Ratten mit Vorhandensein von Endothelzellen (nrEC), isoliert aus 1–3 Tage alten Rattenherzen (n = 3 Isolierungen von n = 60 Herzen, mit n = 3 Kulturreplikate pro Isolierung). h mRNA-Spiegel von Adamtsl3 in unbehandelten primären nrCFBs und nrCFBs, die mit 5 ng IFN-γ stimuliert wurden. Bei den Daten handelt es sich um Streudiagramme (a–d, g–h) oder Violindiagramme f mit Mittelwert ± SEM. Statistische Analysen wurden unter Verwendung des Student-t-Tests im Vergleich zu den jeweiligen Kontrollen (a–d, g–h) durchgeführt. i Daten aus dem EMBL-EBI Single Cell Expression Atlas. Dargestellt sind alle Cluster mit 82 Zelltypen aus 20 Mausgeweben (n = 3 weibliche und n = 4 männliche 10–15 Wochen alte Mäuse)22 und die Extraktion von Endothelzellen, Herzmuskelzellen, Fibroblasten und mesenchymalen Zellen (Fibroblasten-Vorläufer). und die Häufung des Adamtsl3-Ausdrucks (blaue Punkte). Die Maßstabsleiste zeigt die Anzahl der zugeordneten Lesevorgänge pro Million (CPM) an.

Die RNA-in-situ-Hybridisierung in WT-Mausherzen bestätigte die Adamtsl3-Expression nach AB sowohl im Vorhof- als auch im Ventrikelgewebe (Abb. 1e) und zeigte die Adamtsl3-Expression in Bereichen zwischen Kardiomyozyten (CMs). In ähnlicher Weise wurde ADAMTSL3 im LV und im linken Vorhofohr (LAA) (Abb. 1f) von 948 menschlichen Spendern in der Genotype-Tissue Expression (GTEx)-Datenbank exprimiert21. Wir erhielten Primärkulturen aus neugeborenen Rattenherzen, in denen CFBs von CMs getrennt wurden und in der CM-Fraktion vaskuläre Endothelzellen (ECs) gefunden wurden11. Die qPCR-Analyse ergab eine hohe Adamtsl3-Expression in CFBs im Vergleich zu CMs/ECs (Abb. 1g), und ihre Expression in CFBs wurde durch Interferon-γ (IFN-γ) hochreguliert (Abb. 1h), was darauf hindeutet, dass die IFN-γ-Signalübertragung die ADAMTSL3-Produktion stimuliert in CFBs. Bemerkenswert ist, dass die CT-Werte für Adamtsl3 in der CM/EC-Fraktion relativ hoch waren (Abb. S2), und daher wurde die Adamtsl3-Expression in der CM/EC-Fraktion als sehr niedrig angesehen. Wir haben auch die Single Cell Expression Atlas-Datenbank durchsucht, die veröffentlichte Expressionsdaten für 82 Zelltypen aus 20 Mausgeweben enthält22. In Übereinstimmung mit den Daten aus unseren primären Herzkulturen wurden hohe Adamtsl3-mRNA-Spiegel in Clustern von Fibroblasten und mesenchymalen Zellen (Fibroblasten-Vorläufer) beobachtet (Abb. 1i). Es gab eine gewisse Expression in ECs, während die Expression in CMs vernachlässigbar war. Auf dieser Grundlage stammte das Adamtsl3-Signal in der nrCM/nrEC-Fraktion wahrscheinlich von ECs. Diese unabhängigen Datensätze identifizieren Fibroblasten als Hauptproduzenten von ADAMTSL3 im Herzen von Menschen, Mäusen und Ratten.

Mithilfe der CRISPR-Cas9-vermittelten Genbearbeitung wurde ein mutiertes Adamtsl3-Maus-Allel erzeugt (Abb. 2a). Insbesondere führte eine 5-bp-Deletion in Exon 2 (Abb. 2b), das für das Signalpeptid kodiert, zu einem Transkript außerhalb des Rahmens, das die Adamtsl3-Expression eliminierte. Homozygote und heterozygote Mäuse konnten durch Adamtsl3-Genotypisierung, RNA-seq und qPCR unterschieden werden (Abb. S3a–c). Erwachsene L3-KO-Mäuse hatten ein äußerlich normales Aussehen (Abb. S3d) und ein ähnliches Körpergewicht wie WT-Kontrollen (Tabellen SI-SII). Homozygote L3-KO-Mäuse überlebten bis zur Reife ohne erkennbare frühe Letalität und hatten offenbar normale Herzdimensionen und -funktionen, gemessen durch Echokardiographie und Herz-MRT im Alter von 8–12 Wochen (Tabelle SI). Bemerkenswert ist, dass L3-KO-Herzen mehr wogen als WT- (9–13 %) und heterozygote (13,5 %) Wurfgeschwisterherzen (Tabellen SI–SII). Die L3-KO-Tibiaknochen waren länger (2–3 %) als die von WT-Wurfgeschwistern, und daher wurde das Körpergewicht, das in allen drei Genotypen ähnlich war, gegenüber der Tibialänge zur Normalisierung des Organgewichts zu Studienbeginn bevorzugt (Tabellen SI–SII). .

a–b Erzeugung des mutierten Adamtsl3-Allels. a Übersicht über den Adamtsl3-Locus mit kodierenden und nicht-kodierenden Exons. Die durch CRISPR-Cas9 vermittelte Bearbeitung führte zu einer 5-bp-Deletion in Exon 2. b Sequenz um die 5-bp-Deletionszielstelle. Die unterstrichenen Sequenzen geben die zur Genotypisierung verwendeten Primer an. c Schematische Zeitleiste der Mausstudie. Wildtyp-Mäuse (WT) und Adamtsl3-Knockout-Mäuse (L3-KO) wurden einer Aortenbandbildung (AB) oder einer Scheinoperation unterzogen und 6 Wochen lang mit Echokardiographie und Magnetresonanztomographie (MRT) beobachtet. d Kaplan-Meier-Überlebenskurven nach AB. e Änderung des Körpergewichts (KG) gegenüber dem Ausgangswert (%) bei WT und L3-KO nach AB- oder Scheinoperation (n = 8 WT und n = 12 L3-KO). f Absolutes Herzgewicht (HW) nach AB. g Masse des linken Ventrikels (LVM) nach AB. h Dicke des interventrikulären Septums in der Diastole (IVSd), i Dicke der LV-Hinterwand in der Diastole (LVPWd), j LV-Innendurchmesser in der Diastole (LVIDd), zu Studienbeginn und nach AB im Vergleich zur Scheinuntersuchung. k LV enddiastolische Volumina (LVEDV) nach AB. l Fraktionale Verkürzung (FS) zu Studienbeginn und nach AB. m LV-Ejektionsfraktion (LVEF) nach AB. n Durchmesser des linken Vorhofs (LA) zu Studienbeginn im Vergleich zur Scheinuntersuchung. o Absolutes Lungengewicht (LW) in L3-KOs und WTs nach AB. p LV-atriale und gehirnnatriuretische Peptide (Nppa, Nppb) und schwere Ketten von α- und β-Myosin (Myh6, Myh7) 6 Wochen nach der AB- oder Scheinoperation. e–pn = 6 WT und n = 6 L3-KO zu Studienbeginn, n = 12 WT und n = 8–12 L3-KO nach AB und n = 7–8 WT und n = 9–12 L3-KO nach AB Scheinoperation. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. Statistische Analysen wurden unter Verwendung des Log-Rank-Tests (Mantel-Cox) (d), der einfaktoriellen ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest (e, h–j, l, n, p) oder des Student-t-Tests ( f–g, k, m, o). P-Werte werden als numerische p-Werte oder *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001 für AB vs. Schein und $p < 0,05, $$p < 0,01 und $$ angegeben $p < 0,001 für L3-KO AB vs. WT AB.

L3-KO- und WT-Wurfgeschwister wurden durch AB unter Verwendung von O-Ringen mit einem festen Innendurchmesser von 0,55 mm einer erhöhten LV-Nachlast ausgesetzt, wobei in den entsprechenden Kontrollkohorten eine Scheinoperation durchgeführt wurde20. Die Mäuse wurden zu Studienbeginn sowie eine, drei und sechs Wochen nach der Operation mit Echokardiographie und MRT überwacht, und die Herzen wurden eine und sechs Wochen nach der AB entnommen (Abb. 2c). L3-KO-Mäuse hatten nach AB eine hohe Mortalität mit einer Überlebensrate von 62 % nach sechs Wochen, verglichen mit einer Überlebensrate von 96 % bei WTs und einer Überlebensrate von 100 % bei scheinoperierten Mäusen beider Genotypen (Abb. 2d). Die meisten verstorbenen L3-KO-Mäuse starben drei Wochen nach AB an einer schweren Herzfunktionsstörung. Beide Genotypen hatten zu Studienbeginn ein ähnliches Körpergewicht und verloren nach AB im Vergleich zu scheinoperierten Mäusen an Gewicht, aber WTs nahmen im Zeitverlauf nach AB wieder mehr an Gewicht zu als L3-KOs (Abb. 2e). Nach sechs Wochen hatten die überlebenden L3-KOs 10 % ihres Ausgangskörpergewichts verloren (Abb. 2e), und daher wurde das Experiment abgebrochen. Dieser Körpergewichtsverlust stand im Einklang mit einer schädlicheren Auswirkung bei L3-KO im Vergleich zu WT nach AB.

Da L3-KO-Mäuse nach AB mehr Gewicht verloren als WT-Mäuse, wurden die Organgewichte nach der Ernte nicht auf das Körpergewicht normalisiert. Geerntete L3-KO-Herzen wogen nach AB mehr als WT-Herzen (Abb. 2f) und hatten eine größere absolute LV-Masse, berechnet aus MRT-gemessenen Abmessungen (Abb. 2g). Die interventrikuläre Septumdicke (IVSd) (Abb. 2h) und die LV-Hinterwanddicke (LVPWd) (Abb. 2i), gemessen mittels Echokardiographie, waren zu Studienbeginn ähnlich und nahmen bei beiden Genotypen eine Woche nach AB zu, was auf einen ähnlichen Grad der Hypertrophie hindeutet Antwort. Sechs Wochen nach AB war die Hypertrophie jedoch bei den WTs immer noch erkennbar, während die Ventrikelwände bei den L3-KOs dünner waren und sich nicht vom Ausgangswert unterschieden (Abb. 2h-i). Der mittels Echokardiographie gemessene LV-Innendurchmesser (LVIDd) (Abb. 2j) und die mittels MRT gemessenen LV-Volumina (LVEDV) (Abb. 2k) waren während des gesamten Studienverlaufs von einer bis sechs Wochen nach der Untersuchung bei L3-KOs gegenüber WTs erhöht. AB, was auf eine erhöhte Herzdilatation von L3-KO im Vergleich zu WTs hinweist (repräsentative Echokardiographiebilder sind in Abb. S4a-b dargestellt). L3-KOs hatten ab einer Woche nach AB eine geringere fraktionierte Verkürzung (FS) im Vergleich zu WTs (Abb. 2l) und eine geringere LVEF (Abb. 2m), was auf eine verminderte kontraktile Funktion hinweist. Der Durchmesser des linken Vorhofs (LA) (Abb. 2n) und das Lungengewicht (Abb. 2o) waren bei L3-KO sechs Wochen nach AB erhöht, was auf eine Kreislaufstauung hindeutet. Schließlich war die Expression des atrialen natriuretischen Peptids (ANP, Nppa), des natriuretischen Peptids des Gehirns (BNP, Nppb) und der schweren β-Myosin-Kette (Myh7) in L3-KO im Vergleich zu WT-LVs nach sechs Wochen konsistent erhöht (Abb. 2p). mit anhaltendem Umbau und Funktionsstörung der Kardiomyozyten23. Insgesamt zeigen diese Daten, dass L3-KOs bei gleicher Auferlegung der LV-Nachlast eine verstärkte Herzdilatation und kontraktile Dysfunktion mit schnellerem Fortschreiten zur Dekompensation im Vergleich zu WTs entwickelten.

Um die Rolle von ADAMTSL3 als Reaktion auf LV-Drucküberlastung zu verstehen, führten wir eine Woche nach AB eine RNA-seq-Analyse an LVs durch, als beide Genotypen eine Herzhypertrophie zeigten, aber nur L3-KO-Herzen erweitert waren (Abb. 2). In L3-KO-LVs wurden insgesamt 233 differentiell exprimierte Gene (DEGs), 138 hochregulierte und 95 herunterregulierte, mit einer Falscherkennungsrate (FDR) < 0,05 identifiziert (Supplementary Data 1). 21 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)-Pfade wurden anhand der DEGs identifiziert, und die zehn am stärksten angereicherten Pfade umfassten Kardiomyopathien, CM-Funktion und Zell-ECM-Wechselwirkungen (Abb. 3a). Genontologie-Analysen (GO) ergaben eine Anreicherung von 110 biologischen Signalwegen, 50 molekularen Funktionen und 51 Kategorien zellulärer Komponenten. Von den 10 am stärksten angereicherten Kategorien standen mehrere im Zusammenhang mit der Kontraktilität und dem Umbau des Herzens, Zell-ECM-Wechselwirkungen und der TGFβ-Signalisierung (Abb. 3b). -D). Somit ergab eine unvoreingenommene RNA-seq-Analyse die Anreicherung von Signalwegen im Zusammenhang mit einer verschlimmerten Herzfunktionsstörung und einer ECM-regulatorischen Rolle von ADAMTSL3. Wichtig ist, dass zu den am stärksten hochregulierten Genen in L3-KO-Herzen Nppa und Myh7 gehörten, die mit dem Umbau und der Dysfunktion von Kardiomyozyten in Einklang stehen23, sowie Typ-I-Kollagen (Col1a1) und Periostin (Postn), deren Spiegel auf die TGFβ-Signalübertragung reagieren und auf eine erhöhte Fibrose hinweisen24 ( Abb. 3e–g). Ingenuity Pathway Analysis (IPA, Qiagen) sagte MEF2C und TGFβ als wichtige Upstream-Regulatoren (USRs) der CM- bzw. CFB-bezogenen DEGs voraus (Abb. 3h-i, Ergänzende Daten 1).

Eine Drucküberlastung des linken Ventrikels (LV) wurde bei Adamtsl3-Knockout-Mäusen (L3-KO, n = 10) und Wildtyp-Mäusen (WT, n = 6) durch einwöchiges Aortenbanding (AB) und RNA-Sequenzierung induziert wurde an LV-Gewebe durchgeführt. 233 differentiell exprimierte Gene (DEGs, FDR < 0,05) wurden zur Anreicherung der Pfade der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) und der Begriffe der Genontologie (GO) mithilfe des Analyseassistenten Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) v6.849 analysiert . Dargestellt sind die 10 am stärksten angereicherten a-KEGG-Wege, b-GO-biologischen Wege, c-GO-Molekülfunktionen und d-GO-Zellkomponenten, die unter den 233 DEGs identifiziert wurden. e Streudiagramm zum Vergleich von Log-Reads pro Kilobase Million (RPKM) von 233 Grad zwischen L3-KO und WT. Rote Punkte entsprechen kommentierten DEGs im Diagramm. Die vollständige Liste der DEGs (graue und rote Punkte) finden Sie in den Zusatzdaten 1. fg Log2-fache Änderung des mittleren RPKM von DEGs im Zusammenhang mit der Struktur und Funktion der Kardiomyozyten (CM) (f) sowie der extrazellulären Matrix (ECM) und dem Herzen Fibrose (g). Hallo, vorhergesagte vorgelagerte Regulierungsbehörden von DEGs aus Ingenuity Pathway Analysis (IPA).

Da die bioinformatische Analyse der RNA-seq-Daten eine Woche nach AB auf eine erhöhte TGFβ-Aktivität in L3-KO-Herzen hinwies, haben wir die Werte von aktivem TGFβ und pSMAD2, einem entscheidenden Mediator der TGFβ-Signalübertragung5, durch Immunblotting gemessen. Eine und sechs Wochen nach AB waren die Werte an aktivem TGFβ in L3-KO-Herzen höher als in WT-Herzen (Abb. 4a). Nach einer Woche AB war pSMAD2 in L3-KO-Herzen im Vergleich zu Schein-Herzen erhöht, und nach sechs Wochen AB war pSMAD2 in L3-KO-Herzen höher als in WT-Herzen (Abb. 4b), was auf eine erhöhte TGFβ-Signalübertragung in L3-KO-Herzen hinweist. KO-Herzen. Dementsprechend zeigten L3-KO-Herzen nach sechs Wochen eine erhöhte Expression von TGFβ (Tgfb1) und dem nachgeschalteten Ziel des TGFβ-Signals, dem Bindegewebswachstumsfaktor (Ctgf) (Abb. 4c). Postn stieg in beiden AB-Gruppen vergleichbar an, während Ltbp1 in allen Gruppen unverändert blieb (Abb. 4c).

a–c Wildtyp-Mäuse (WT) und Adamtsl3-Knockout-Mäuse (L3-KO) wurden insgesamt 6 Wochen lang einem Aortenband (AB) oder einer Scheinoperation unterzogen. a,b Repräsentative Immunblots und Quantifizierungen von aktivem TGFβ1/Gesamtprotein (a) und phosphoryliertem SMAD2 (pSMAD2)/Gesamt-SMAD2 (b) in LV-Lysaten, 1 Woche (Schein: n = 4 WT und n = 4 KO, AB: n = 6-8 WT und n = 12 KO) und 6 Wochen (Schein: n = 4 WT und n = 4 KO, AB: n = 12 WT und n = 8 KO) nach AB. c mRNA/Rpl32-Spiegel von TGFβ (Tgfb1), Bindegewebswachstumsfaktor (Ctgf), Periostin (Postn) und latentem TGFβ-Bindungsprotein 1 (Ltbp1) in AB-Mäusen im Vergleich zu Scheinmäusen 6 Wochen nach AB (Schein: n = 8 WT und n = 8 KO, AB: n = 10 WT und n = 7 KO). Statistische Analysen wurden unter Verwendung der einfaktoriellen ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest durchgeführt, mit *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001 für AB vs. Schein und $p < 0,05, $$p < 0,01 und $$$p < 0,001 für L3-KO AB vs. WT AB. dk Menschliche fetale Herzfibroblasten, die 7 Tage lang kultiviert wurden, ein reichhaltiges extrazelluläres Matrixnetzwerk (ECM) produzieren und am 4. Tag mit ADAMTSL3 (L3) oder Kontroll-Adenovirus (Vehikel, Veh) transduziert wurden. Die Daten stellen Experimente aus 3 verschiedenen Zellpassagen dar. d Repräsentativer Immunoblot und Quantifizierung von ADAMTSL3/Gesamtprotein in Veh- (n = 9) und L3-Lysaten (n = 11). e 62 herunterregulierte und 22 hochregulierte Gene in gepoolten L3 vs. Veh-mRNA-Proben (n = 18 in beiden Gruppen) unter Verwendung eines Expressionsarrays von 84 TGFβ-verwandten Genen, Daten sind auf GAPDH normalisierte ΔΔCT-Werte. f–g mRNA/RPL4-Spiegel aus qPCR von TGFB1, LTBP1, CTGF, POSTN (f) und MALAT1 (g) in L3 (n = 16) vs. Veh (n = 18). h–k Repräsentativer Immunoblot und Quantifizierung von pSMAD2/SMAD2 (h), aktivem TGFβ1/Gesamtprotein (i), Latenz-assoziiertem Protein (LAP)/Gesamtprotein, einschließlich des großen latenten Komplexes (LLC, > 250 kDa) (j), und latentes TGFβ-bindendes Protein (LTBP1)/GAPDH, einschließlich LLC (k), in L3- (n = 8-9) vs. Veh- (n = 8) Zell- und extrazellulären Matrixlysaten. Statistische Analysen wurden mit dem Student-t-Test (d, fk) durchgeführt. Alle Daten (außer e) werden als Einzelwert-Streudiagramme mit Mittelwert ± SEM angezeigt.

Für weitere mechanistische Erkenntnisse haben wir ADAMTSL3 (L3) in voller Länge und ein Vehikelkontroll-Adenovirus (veh) in Kulturen menschlicher fötaler CFBs (hfCFBs) überexprimiert (Abb. S5a), die ein umfangreiches ECM-Netzwerk bilden11. Die Überexpression von ADAMTSL3 wurde durch erhöhte mRNA (Abb. S5b) und Protein (Abb. 4d) bestätigt. Unter Verwendung eines Expressionsarrays, das auf 84 Gene des TGFβ-Signalwegs in gepoolten L3- und Veh-Proben abzielt, fanden wir 62 herunterregulierte und 22 hochregulierte Gene in L3 (Abb. 4e). Mehrere zentrale Mediatoren der kanonischen TGFβ-Signalübertragung, z. B. TGFB1, TGFB2, SMAD3, SMAD4, TGFBR1, wurden herunterreguliert und der TGFβ-Signalinhibitor SMAD6 wurde hochreguliert. Bei der Analyse einzelner L3- und Veh-Proben stellten wir fest, dass die Gene, die für die Komponenten des großen latenten TGFβ-Komplexes (LLC), d. h. TGFB1 und LTBP1, die TGFβ-Signalziele CTGF und POSTN sowie den TGFβ-Signalverstärker MALAT125, kodieren, herunterreguliert waren L3 (Abb. 4f-g). Immunoblotting ergab einen verringerten pSMAD (Abb. 4h) und einen verringerten aktiven TGFβ (Abb. 4i), was auf eine verringerte TGFβ-Signalübertragung hinweist. Darüber hinaus waren die Spiegel des LLC, bestehend aus dem vom TGFB1-Gen transkribierten Latenz-assoziierten Peptid (LAP), und LTBP1 in L3-Zell- und ECM-Lysaten verringert (Abb. 4j-k), was auf eine verringerte TGFβ-Produktion hinweist. Zusammengenommen legen die Studien zum Funktionsverlust und Funktionsgewinn nahe, dass ADAMTSL3 ein Inhibitor der TGFβ-Signalübertragung im Herzen in vivo und in Herzfibroblasten in vitro ist.

Zur Beurteilung der Myokardfunktion wurde eine kardiale MRT mit Gewebephasenkartierung (TPM) durchgeführt. Beide Genotypen entwickelten nach AB eine verringerte Längs- und Umfangsspitzendehnung, was auf eine systolische Dysfunktion schließen lässt (Abb. S6a-b). Darüber hinaus entwickelten beide Genotypen eine verringerte frühdiastolische Belastungsrate (SRe), ​​was auf eine weniger wirksame Entspannung hinweist (Abb. S6c-d), und nach drei Wochen zeigte L3-KO im Vergleich zu WT eine verringerte LV-Umfangs-SRe (Abb. S6d). Die Doppler-Echokardiographie bestätigte eine relative Beeinträchtigung der Herzfunktion bei L3-KO im Vergleich zu WT, da die maximale Mitraleinflussgeschwindigkeit (E) (Abb. S6e) und die Verzögerung des Mitralklappeneinflusses (MVD) (Abb. S6f) bei L3-KO verringert waren. Die verringerte SRe im L3-KO kann auf eine LV-Steifheit zurückzuführen sein, die mit einer Myokardfibrose zusammenhängen kann. Als nächsten Schritt untersuchten wir daher die Auswirkungen von ADAMTSL3 auf die ECM-Genexpression und -Biosynthese.

In den RNA-seq-Daten fanden wir eine Woche nach AB ein hochreguliertes Col1a1 in L3-KO gegenüber WT (Abb. 3g), was auf eine erhöhte Kollagenproduktion zu diesem Zeitpunkt hindeutet. Wir suchten daher nach Hinweisen auf eine Fibrose in mittelventrikulären Abschnitten von WT- und L3-KO-Mäusen. Eine Woche nach AB zeigte die Trichrom-Färbung bei beiden Genotypen vergleichbare Kollagenwerte, d. S7a). Wir quantifizierten auch den Kollagen-I-Proteingehalt anhand der Hydroxyprolinspiegel in LVs eine Woche nach der AB, was im Einklang mit der Histologie auf einen ähnlichen Anstieg des Kollagengehalts in L3-KO und WT nach AB im Vergleich zur Scheinuntersuchung hinwies (Abb. 5b). . Sechs Wochen nach AB waren die mRNA von Kollagen I (Col1a1 und Col1a2) und Kollagen III (Col3a1) in beiden Genotypen in ähnlichem Maße erhöht, wie mit qPCR beurteilt (Abb. 5c). Ebenso war die Trichromfärbung der mittelventrikulären Abschnitte bei beiden Genotypen vergleichbar, d. h. 5,5 % Kollagen im WT und 6,4 % L3-KO sechs Wochen nach AB (Abb. 5d und repräsentative Bilder in Abb. S7b). Somit wurde kein Unterschied in der Gewebekollagenmenge zwischen den Genotypen zu den beiden untersuchten Zeitpunkten nach AB festgestellt.

a–f Wildtyp-Mäuse (WT) und Adamtsl3-Knockout-Mäuse (L3-KO) wurden 1 und 6 Wochen lang einem Aortenband (AB) oder einer Scheinoperation unterzogen. a % Gesamtkollagen des linken Ventrikels (LV), berechnet aus mit Picrosirius Red, Fast Green und Alcian Blue (RGB) gefärbten histologischen Schnitten aus der Mitte des Ventrikels 1 Woche nach AB (Schein: n = 5 WT und n = 5 KO, AB: n = 5 WT und n = 5 KO). b LV-Typ-I-Kollagengehalt, gemessen durch Peak-Hydroxyprolin-HPLC, 1 Woche nach AB (Schein: n = 6 WT und n = 5 KO, AB: n = 6 WT und n = 7 KO). c LV-mRNA/Rpl32-Spiegel der Kollagene Typ I (Col1a1, Col1a2) und Typ III (Col3a1) und Lysyloxidase (Lox) (Schein: n = 8 WT und n = 8 KO, AB: n = 10 WT und n = 7 KO). d LV % Gesamtkollagen in mittelventrikulären Abschnitten 6 Wochen nach AB (Schein: n = 3 WT und n = 3 KO, AB: n = 4 WT und n = 4 KO). e Spiegel des Gesamtkollagens, des löslichen Kollagens, des unlöslichen Kollagens und der Kollagenvernetzung in den LVs 6 Wochen nach der AB, unter Verwendung kolorimetrischer und enzymatischer Verfahren an mittelventrikulären Abschnitten (n = 7 WT und n = 7 KO). (f) mRNA/Rpl32-Spiegel von Fibrillin-1/2 (Fbn1, Fbn2), Tropoelastin (Eln1) und Fibronektin-1 (Fn1), in L3-KO vs. WT (Schein: n = 8 WT und n = 8 KO, AB: n = 10 WT und n = 7 KO). Statistische Analysen wurden unter Verwendung der einfaktoriellen ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest (a–d, f) oder dem Student-t-Test (e) durchgeführt. P-Werte werden als exakte p-Werte oder *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001 für AB vs. Schein und $p < 0,05, $$p < 0,01 und $$ angegeben $p < 0,001 für L3-KO AB vs. WT AB. g–h, j Menschliche fetale Herzfibroblasten (hfCFBs) wurden 7 Tage lang kultiviert, wodurch ein reiches extrazelluläres Matrixnetzwerk (ECM) entstand, und am 4. Tag mit ADAMTSL3 (L3) oder Kontroll-Adenovirus (Vehikel, Veh) transduziert. Die Daten stellen Experimente dar in 3 verschiedenen Zellpassagen. g ΔΔCT-Expressionswerte, normalisiert auf GAPDH, von 53 herunterregulierten und 25 hochregulierten Genen in gepoolten L3 vs. Veh-mRNA-Proben (n = 18 in beiden Gruppen) unter Verwendung eines Expressionsarrays von 78 Zelladhäsions- und ECM-bezogenen Genen. h mRNA/RPL4-Spiegel aus qPCR von COL1A1, COL1A2, COL3A1, LOX in L3 (n = 16) vs. Veh (n = 18). i Kollagenproteinsynthese, gemessen durch radioaktiven Zerfall (Anzahl pro Minute) von [3H]-Prolin, eingebaut über 48 Stunden in L3- und Veh-CFBs, isoliert aus 1–3 Tage alten Ratten (n = 3 Isolierungen mit n = 60). Herzen ergeben n = 3–4 technische Replikate pro Isolierung). j mRNA/RPL4-Spiegel aus qPCR von FBN1, FBN2, ELN und FN1 in L3 (n = 16) vs. Veh (n = 18) hfCFBs. Die statistische Analyse wurde mit dem Student-t-Test (hj) durchgeführt. Alle Daten (außer g) werden als Einzelwert-Streudiagramme mit Mittelwert ± SEM angezeigt.

Die Lysyloxidase (Lox)-mRNA war in L3-KO im Vergleich zu WT sechs Wochen nach AB um das 1,7-fache erhöht (Abb. 5c), was auf eine erhöhte Kollagenvernetzung in L3-KO hinweisen könnte. Wir analysierten daher den Gesamtgehalt an löslichem und unlöslichem Kollagen sechs Wochen nach der AB mithilfe kolorimetrischer und enzymatischer Tests an mittelventrikulären Schnitten. Wichtig ist, dass L3-KO-LVs im Vergleich zu WT einen höheren Anteil an unlöslichem Kollagen aufwiesen (Abb. 5e). Der Unterschied in der berechneten Kollagenvernetzung (Verhältnis zwischen unlöslichem und löslichem Kollagen) erreichte jedoch zwischen den Genotypen keine Signifikanz (p = 0,139) (Abb. 5e).

Um zu untersuchen, ob ADAMTSL3 die ECM-Expression in vitro reguliert, verwendeten wir ein Expressionsarray, das auf 78 ECM- und Zelladhäsionsgene abzielte, und fanden 53 herunterregulierte und 25 hochregulierte Gene in gepoolten Proben von L3 vs. Veh. Mehrere Zelladhäsionsgene wurden hochreguliert, z. B. SELL, SELP, PECAM1 und VCAM1. Im Einklang mit der erhöhten Expression in L3-KO-AB-Herzen wurden COL1A1, ITGB1 und CTGF in L3 herunterreguliert, ebenso wie mehrere sekretierte und Zelloberflächenmatrix-Metalloproteinasen (MMPs) und ADAMTS-Proteasen (Abb. 5g). In einzelnen hfCFB-Proben wurde eine verringerte COL1A1-Expression bestätigt, wohingegen COL3A1 unverändert blieb (Abb. 5h). Die Kollagenproteinproduktion wurde in L3 vs. Veh-nrCFBs mit einem sich entwickelnden ECM (Abb. S5c-d) unter Verwendung des Einbaus von radioaktiv markiertem Prolin weiter untersucht. Wichtig ist, dass wir herausfanden, dass L3-Kulturen 25 % weniger Radioprolin enthielten als Veh (Abb. 5i), was darauf hindeutet, dass ADAMTSL3 die Kollagenproteinspiegel von Herzfibroblasten hemmt. In Übereinstimmung mit der erhöhten Lox-Expression in L3-KO-Herzen (Abb. 5c) reduzierte die L3-Überexpression in hfCFB die LOX-mRNA (Abb. 5h), was darauf hindeutet, dass ADAMTSL die Kollagenvernetzung hemmen könnte. In L3-KO-Herzen war die Elastin-Expression (Eln) sechs Wochen nach AB 1,8-fach höher als die von Veh, während die Expression von Fibrillinen (Fbn1/2) und Fibronektin (Fn1) unverändert blieb (Abb. 5f). Schließlich wurde die Mikrofibrillenexpression in hfCFBs-Kulturen analysiert, die ein ausgedehntes Mikrofibrillennetzwerk produzieren11, und zeigte eine verringerte Expression von FBN1, FBN2, ELN und FN1 in L3 im Vergleich zu Veh (Abb. 5j). Insbesondere unterstützen Fibronektinfibrillen den Zusammenbau von Kollagen I, Fibrillin-Mikrofibrillen, Elastin und LTBP-1 im ECM26. Zusammengenommen zeigen unsere Daten, dass ADAMTSL3 die Kollagensynthese und -vernetzung sowie die Synthese anderer struktureller ECM-Moleküle in hfCFB-Kulturen und als Reaktion auf Drucküberlastung beeinflusst.

Osteopontin (SPP1) ist für die Myofibroblastendifferenzierung essentiell und wurde als das am stärksten herunterregulierte Molekül im Expressionsarray von L3 vs. Veh identifiziert (Abb. 5g). Daher untersuchten wir die Myofibroblastendifferenzierung in WT- und L3-KO-Herzen. Wir fanden vergleichbare Expressionsniveaus des Myofibroblasten-Signaturmarkers α-SMA (Acta2) zwischen den Gruppen eine Woche und sechs Wochen nach AB (Abb. 6a), aber das Immunblotting für α-SMA-Protein ergab einen 2,5-fachen Anstieg von L3-KO vs. WT eine Woche nach AB (Abb. 6b), was auf eine erhöhte Myofibroblastendifferenzierung hinweist. Die SPP1-Expression war in beiden Genotypen nach AB erhöht, mit höheren Werten in L3-KO-Herzen im Vergleich zu WT (Abb. 6c), was auf Proteinebene weiter bestätigt wurde (Abb. 6d). Die ACTA2-Expression war in L3-hfCFB-Kulturen im Vergleich zu Veh um 40 % reduziert (Abb. 6e) und das α-SMA-Protein war um 25 % reduziert (Abb. 6f). Wir bestätigten eine Herunterregulierung von SPP1 in einzelnen L3-hfCFB-Proben auf 10 % des Veh-Spiegels (Abb. 6g) und eine 40 %ige Reduzierung des Osteopontin-Proteins im Vergleich zu Veh (Abb. 6h), was auf eine verringerte Myofibroblastendifferenzierung hinweist. Als nächstes wurden die profibrotischen Merkmale aktivierter CFBs untersucht, d. Chromosomenerhaltungskomplexkomponente 2 (MCM2) in L3 (Abb. 6i) sowie verringerter EdU-Einbau (Abb. 6j). Am signifikantesten war, dass ADAMTSL3-überexprimierende Zellen eine verringerte Fähigkeit zur Kontraktion von Kollagengelen zeigten (Abb. 6k), was einen funktionellen Hinweis auf eine beeinträchtigte Myofibroblastendifferenzierung lieferte.

a–d Wildtyp-Mäuse (WT) und Adamtsl3-Knockout-Mäuse (L3-KO) wurden 1 und 6 Wochen lang einem Aortenband (AB) oder einer Scheinoperation unterzogen. a mRNA/Rpl32-Spiegel von α-Aktin der glatten Muskulatur (α-SMA, Acta2). b Repräsentative Immunoblots und Quantifizierung von α-SMA in LV-Proteinextrakten von WT und L3-KO 1 und 6 Wochen nach der AB- oder Scheinoperation. c mRNA/Rpl32-Spiegel von Osteopontin (OPN, Spp1). d Repräsentative Immunoblots und Quantifizierung von OPN in LV-Proteinextrakten von WT und L3-KO 1 und 6 Wochen nach der AB- oder Scheinoperation. 1 Woche nach AB, n = 4–5 WT und n = 4 KO Schein und n = 6–7 WT und n = 8–9 KO AB. 6 Wochen nach AB, n = 4–8 WT und n = 4–8 KO Schein und n = 10–12 WT und n = 7–8 KO AB. Statistische Analysen wurden unter Verwendung der einfaktoriellen ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest (ad) durchgeführt. P-Werte werden als *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001 für AB vs. Schein und $p < 0,05, $$p < 0,01 und $$$p < 0,001 für angegeben L3-KO AB vs. WT AB. e–k Menschliche fetale Herzfibroblasten (hfCFBs) wurden 7 Tage lang kultiviert, wodurch ein reichhaltiges Netzwerk der extrazellulären Matrix (ECM) entstand, und am 4. Tag mit ADAMTSL3 (L3) oder Kontroll-Adenovirus (Vehikel, Veh) transduziert. Die Experimente wurden am 3. Tag durchgeführt verschiedene Zellpassagen. e ACTA2/RPL4-Spiegel in L3 (n = 16) vs. Veh (n = 18). f Repräsentativer Immunblot und Quantifizierung von α-SMA/GAPDH in L3 (n = 8) vs. Veh (n = 8). g SPP1/RPL4-Spiegel in L3 (n = 16) vs. Veh (n = 18). f Repräsentativer Immunblot und Quantifizierung von OPN/Gesamtprotein in L3 (n = 8) vs. Veh (n = 8). i mRNA-Spiegel/RPL4 des proliferierenden Zellkernantigens (PCNA), des Proliferationsmarkers Ki-67 (KI67) und der Komponente 2 des Mini-Chromosomen-Erhaltungskomplexes (MCM2) in L3 (n = 18) vs. Veh (n = 18). j Relative Fluoreszenzeinheiten (RFU), die den EdU-Einbau als Maß für die Proliferation in L3 im Vergleich zu Veh (n = 48) widerspiegeln. Die Daten werden mit Mittelwert ± SEM (a–j) angegeben. k Kollagen-Gelkontraktion von hfCFBs, als prozentuale Kontraktion der anfänglichen Gelfläche, nach 2, 4 und 6 Stunden, in L3 (n = 12) vs. Veh (n = 24). Die statistische Analyse wurde unter Verwendung des Student-t-Tests (p–k) durchgeführt, wobei die p-Werte als numerische Werte (e–j) oder **p < 0,01 und ***p < 0,001 angegeben wurden, sowie die zweifach wiederholten Messungen ANOVA mit der Geisser-Greenhouse-Korrektur zum Vergleich mehrerer Zeitpunkte (k, genauer p-Wert in der Grafik dargestellt).

Im Einklang mit der verminderten Kontraktilität in L3-KO-Herzen nach AB zeigte die RNA-Sequenz fehlregulierte CM-Sarkomer- und Kontraktilitätsgene, z. B. den Ryanodinrezeptor (Ryr2), Titin (Ttn), den Natrium-Kalzium-Austauscher (NCX, Slc8a1) und SERCA (Atp2a2) und Phospholamban (Pln) (Abb. 3e – g). Daher untersuchten wir isolierte CMs aus erwachsenen WT- und L3-KO-Mäusen. CMs hatten zwischen den Genotypen eine ähnliche Größe (Abb. S8a) und eine vergleichbare Ruhesarkomerlänge (Abb. S8b). Während der elektrischen Stimulation bei 1 Hz zeigten CMs ähnliche Kontraktionsgrößen, mit paralleler Zellverkürzung durch Isoproterenol-Exposition (Abb. S8c) und ähnlichen Kontraktions- (Abb. S8d) und Relaxationskinetiken (Abb. S8e), was auf eine normale CM-Entwicklung in L3- hindeutet. KO-Herzen. Da der Phänotyp isolierter CMs in WT und L3-KO ähnlich war und in CMs keine Adamtsl3-Expression nachgewiesen wurde (Abb. 1i), wurde die bei L3-KO nach AB beobachtete verstärkte kontraktile Dysfunktion als sekundär zu veränderter ECM und CFB interpretiert Funktion.

In der vorliegenden Studie untersuchten wir die Regulation von ADAMTSL3 in Biopsien von Patienten mit Herzinsuffizienz und seine Rolle beim kardialen Umbau nach AB-induzierter LV-Drucküberlastung bei L3-KO- und WT-Wurfgeschwistermäusen. ADAMTSL3 wurde in versagenden Herzen von Patienten und Mäusen nach AB hochreguliert und wurde hauptsächlich von CFBs produziert. Wichtig ist, dass L3-KO-Mäuse eine verstärkte kontraktile Dysfunktion und LV-Dilatation zeigten, mit einer höheren Mortalität nach LV-Drucküberlastung. Molekulare Analysen von L3-KO- und WT-Herzen nach AB ergaben eine erhöhte TGFβ-Signalübertragung, CFB-Aktivierung und eine fehlregulierte ECM-Produktion mit erhöhten Mengen an unlöslichem Kollagen in L3-KO. Die Überexpression von ADAMTSL3 in kultivierten CFBs hemmte die TGFβ-Signalübertragung, die Myofibroblastenumwandlung, die ECM-Expression und die Kollagensynthese. Insgesamt deuten unsere Daten auf eine kardioprotektive Rolle von ADAMTSL3 im versagenden Herzen durch Hemmung der TGFβ-Aktivität und Myofibroblastendifferenzierung hin, mit Konsequenzen für die kardiale ECM, den kardialen Umbau und die Funktion bei pathogenen Reizen.

Die ADAMTSL3-Spiegel waren in Herzbiopsien von Patienten mit Herzinsuffizienz erhöht und unsere Studien an Mäusen zeigen eine wichtige Rolle von ADAMTSL3 für die Herzfunktion und das Überleben. Nach Drucküberlastung des linken Ventrikels kam es im L3-KO zu einer verstärkten kontraktilen Dysfunktion und einer Herzdilatation. Die RNA-Seq von Post-AB-Herzen ergab DEGs, die mit Kardiomyopathie, CM-Kalzium-Handhabung und Kontraktilität im L3-KO assoziiert sind. Da wir keine Adamtsl3-Expression in CMs feststellen konnten und kein Unterschied in der CM-Funktion zwischen isolierten L3-KO- und WT-CMs festgestellt wurde, interpretieren wir die verringerte Herzfunktion in L3-KOs als sekundär zu einer veränderten ECM-Regulation durch CFBs.

Zu Studienbeginn waren L3-KO-Mäuse lebensfähig und hatten ein normales Körpergewicht ohne erkennbaren Phänotyp, mit Ausnahme etwas längerer Gliedmaßen. Obwohl die durch Echokardiographie und MRT gemessene Grundfunktion oder -dimension des Herzens durch die Adamtsl3-Inaktivierung nicht beeinträchtigt wurde, hatten Herzen von nicht gestressten L3-KO-Mäusen ein erhöhtes Gewicht. Dies weist darauf hin, dass die Interpretation des Post-AB-Herzphänotyps mit Vorsicht erfolgen sollte, da die L3-KO-Herzen möglicherweise als Reaktion auf einen Stressor für eine Verschlimmerung der Erkrankung prädisponiert sind.

Importantly, our study directly links ADAMTSL3 to cardiac function. This link was previously suggested, as ADAMTSL3 is part of a rare syndrome known as Tetrasomy 15q25, arising from an inverted duplication of the distal chromosome 15qter identified with SNP microarray in a patient with multiple anomalies including complex cardiovascular malformation. Am. J. Med. Genet. A 158a, 1971–1976 (2012)." href="/articles/s42003-022-04361-1#ref-CR27" id="ref-link-section-d79610379e2679"> 27,28. Zu den Patientenmerkmalen gehören Wachstumsstörungen und komplexe Herzfehlbildungen, die mit einer hohen Mortalität einhergehen28. Die phänotypischen Herzfehler treten nur dann auf, wenn ADAMTSL3 Teil der chromosomalen Duplikation ist28. Herzfehler werden auch bei Patienten mit einer heterozygoten chromosomalen Mikrodeletion derselben Region berichtet, einschließlich ADAMTSL329,30.

Die funktionelle Beziehung zwischen Mitgliedern der ADAMTSL-Familie und Fibrillin-Mikrofibrillen13,15,17 legt nahe, dass ADAMTSLs als Regulatoren von TGFβ fungieren, eine Funktion, die zuvor für ADAMTSL211,31 und ADAMTSL614 nachgewiesen wurde. Unsere Studie ergänzt die wachsende Zahl an Beweisen, die darauf hinweisen, dass ADAMTSL-Proteine ​​an der TGFβ-Regulation beteiligt sind, da wir hier erhöhte Spiegel und Aktivität von TGFβ in L3-KO-Herzen nach AB sowie eine Hemmung von TGFβ in kultivierten CFBs, die ADAMTSL3 überexprimieren, zeigen. Da TGFβ ein wichtiger Regulator der CFB-Aktivierung und der profibrotischen ECM-Produktion im versagenden Herzen ist7,32, könnte dies darauf hindeuten, dass ADAMTSL3 ein negativer Regulator der fibrotischen und pathogenen Signalübertragung im Herzen ist. ADAMTSL3 regulierte die CFB-Aktivierung in Mäuseherzen sowie in kultivierten menschlichen CFBs, was sich in veränderten Spiegeln der Myofibroblastenmarker α-SMA und Osteopontin sowie einer beeinträchtigten CFB-Kontraktion als Reaktion auf die Überexpression von ADAMTSL3 zeigte. In kultivierten menschlichen CFBs führte die Überexpression von ADAMTSL3 zu einer veränderten Expression von ECM-Molekülen, einschließlich Kollagen. Obwohl wir in vivo keine Veränderungen des Gesamtkollagens in Herzen beobachteten, führte die Inaktivierung von Adamtsl3 zu einer veränderten ECM-Qualität im Myokard mit erhöhten Mengen an unlöslichem Kollagen, was unserer Vermutung nach auf eine verstärkte Expression von Lox zurückzuführen sein könnte. Jüngste Erkenntnisse deuten darauf hin, dass das versagende Herz unterschiedliche Populationen aktivierter CFBs enthält, die unterschiedliche Eigenschaften aufweisen, wie z. B. stark kontraktil oder stark kollagenproduzierend4,33. Wir spekulieren, dass ADAMTSL3 die Differenzierung spezifischer Myofibroblastenpopulationen beeinflussen könnte, die das Myokard auf andere Weise als nur durch die bloße Kollagenproduktion umgestalten. Tatsächlich wurden über 30 fehlregulierte ECM-Gene in aktivierten Myofibroblasten aus verletzten Herzen identifiziert34. Nach der Überexpression von ADAMTSL3 in CFBs fanden wir eine verringerte Expression von FBN1, FBN2, FN1 und ELN, was auf eine Regulierung der ECM-Proteine ​​hindeutet, die den latenten TGFβ-Komplex binden. Die Eln-Expression war in den L3-KO-Herzen entsprechend erhöht.

TGFβ ist seit langem als potenzielles therapeutisches Ziel bei Herzerkrankungen attraktiv, die klinische Umsetzung ist jedoch durch Nebenwirkungen begrenzt32 und alternative Strategien zur Hemmung des TGFβ-Signalwegs sind gerechtfertigt35. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass die Differenzierung von Myofibroblasten im versagenden Herzen reversibel ist35 und könnte ein wichtiges Behandlungsziel sein. Ob ADAMTSL3 ein therapeutisches Potenzial zur Hemmung der Myofibroblastendifferenzierung besitzt, muss noch gezeigt werden. Mechanistisch gesehen bindet ADAMTSL3 an Fibrillin-1 und LTBP113, was auf einen möglichen Mechanismus zur Regulierung der TGFβ-Aktivität hinweist. Wir schlagen vor, dass ADAMTSL3 die TGFβ-Bioverfügbarkeit in der ECM einschränkt, möglicherweise in Verbindung mit ADAMTSL211. Wir schlagen außerdem IFN-γ, einen negativen Regulator von TGFβ und profibrotischer Signalübertragung im Herzen36,37, als vorgeschalteten Regulator von ADAMTSL3 vor.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die erhöhte Mortalität und der verschlechterte Herzphänotyp von L3-KO-Mäusen nach Drucküberlastung auf eine kardioprotektive Rolle von ADAMTSL3 im versagenden Herzen schließen lassen. Mechanistisch gesehen deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass ADAMTSL3 die Herzfunktion durch Einschränkung der TGFβ-Aktivierung und Myofibroblastendifferenzierung unterstützt. In zukünftigen Untersuchungen könnte dieser Möglichkeit durch eine experimentelle Erhöhung der ADAMTSL3-Spiegel in Modellen von Herzerkrankungen begegnet werden, um mögliche kardioprotektive Wirkungen aufzudecken.

Die Verwendung menschlicher Herzbiopsien wurde vom Regionalkomitee für medizinische Forschungsethik (REK ID 07482a und 2010/2226) der südöstlichen regionalen Gesundheitsbehörde, Norwegen, genehmigt und steht im Einklang mit der Deklaration von Helsinki. Alle Patienten oder die nächsten Angehörigen der Spenderkontrollen unterzeichneten eine schriftliche Einverständniserklärung. Die Biopsien wurden am Universitätskrankenhaus Oslo (OUH) entnommen und alle Patienten erhielten eine standardmäßige klinische Untersuchung, Behandlung und Nachsorge gemäß den Krankenhausrichtlinien. Die Mausmodelle und Experimente wurden von der Cleveland Clinic IACUC (Protokollnummer 2020-2450) und dem norwegischen National Animal Research Committee (Genehmigungs-ID 16614) genehmigt und entsprachen dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren sowie die ARRIVE-Richtlinien für die Berichterstattung über Tierversuche.

Von Patienten mit symptomatischer AS wurden während einer Operation am offenen Herzen zum Aortenklappenersatz Biopsien der freien LV-Wand (n = 11) entnommen. Kontroll-LV-Biopsien (n = 11) wurden aus normal kontrahierendem Gewebe von Patienten entnommen, die sich einer Operation wegen koronarer Herzkrankheit unterzogen. Die Patienteneigenschaften wurden bereits zuvor beschrieben18. Kurz gesagt, alle Patienten hatten eine EF > 50 %. AS-Patienten hatten einen nicht erweiterten LV (LVIDd 4,81 ± 0,23 cm) und hypertrophe LV-Wände (IVSd 1,26 ± 0,06 cm und LVPWd 1,22 ± 0,07 cm). Aufgrund des begrenzten Probenmaterials wurde aus dieser Kohorte nur RNA isoliert.

LV-Biopsien von Patienten mit sekundärer, ischämischer DCM (n = 20) wurden aus schlagenden Herzen unmittelbar nach der Explantation entnommen. Als Kontrolle diente LV-Gewebe von nicht erkrankten Herzen, die für eine Transplantation in Frage kamen, aber aus chirurgischen Gründen abgelehnt wurden (n = 3 RNA- und n = 7 Proteinproben). Patienten- und Spendermerkmale wurden bereits zuvor beschrieben19. Kurz gesagt: Die Herzen waren erweitert (LVIDd 7,41 ± 0,22 cm), hatten eine verminderte systolische Funktion (LVEF 19,2 ± 1,6 %) und die Wände waren nicht hypertrophisch (IVSd 0,81 ± 0,05 cm bzw. LVPWd 0,71 ± 0,02 cm). Gewebeproben wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –70 ° C gelagert.

Mit CRISPR/Cas9 wurde in C56BL/6 J-Mäusen ein neues mutiertes Adamtsl3-Allel erzeugt. Eine Leit-RNA (gRNA) mit der Sequenz 5' CAGCCACCAGGATCCTGTCC 3' (Sequenz des Protospacer-benachbarten Motivs (PAM) unterstrichen) wurde für das Targeting von Exon 2 (dem Signalpeptid) des Adamtsl3-Gens (ENSMUST00000173828.2) ausgewählt. gRNA wurde in vitro von Applied StemCell Inc (Milpitas, CA, USA) transkribiert, um einzelne gRNA-Moleküle zu erzeugen. Die Sanger-Sequenzierung der PCR-amplifizierten Zielregion ergab eine Aktivität von 62,5 %. Dementsprechend wurde diese gRNA zusammen mit dem Cas9-Protein in C57BL/6 J-Embryonen injiziert, die auf CD1-Ersatzmütter übertragen und durch anschließende PCR-Amplifikation der Zielregion mithilfe genomischer DNA und Sequenzanalyse analysiert wurden. Eine Gründermaus mit einer durch die Sanger-Sequenz validierten 5-bp-Deletion mit Keimbahnübertragung des mutierten Allels wurde zurückbehalten und in den Stamm C57BL/6 J eingekreuzt. WT- und L3-KO-Ohrbiopsien wurden unter Verwendung des WT-Vorwärtsprimers: 5'-GGCTTCCTGGACAGGATCC-3' oder des L3-KO-Vorwärtsprimers: 5'-CCCATGGCTTCCTGGATCC-3' und eines gemeinsamen Rückwärtsprimers: 5'-GGGTGTGTTAACAGTGAATCC- genotypisiert. 3', in zwei getrennten PCR-Reaktionen, mit resultierenden PCR-Produkten von 428 bp (Abb. S3a). Die ablatierte Expression von Adamtsl3 in L3-KO-Herzen wurde durch RNA-seq (Abb. S3b) und RT-qPCR (Abb. S3c) von LV-Gewebe bestätigt.

Bei 8 bis 11 Wochen alten männlichen L3-KO- und WT-Wurfgeschwistern wurde durch einen erfahrenen Mauschirurgen, der keinen Genotyp hatte, eine Überlastung des Herzdrucks durch eine erhöhte LV-Nachlast induziert. Die hochpräzise Bandierung der aufsteigenden Aorta (AB) wurde mithilfe eines verbesserten Verfahrens, wie kürzlich beschrieben, mit Nitril-O-Ringen mit einem festen Innendurchmesser (0,55 mm)20 anstelle einer Naht durchgeführt, was zu einer reproduzierbaren Einschränkung des Blutflusses führte. niedrige postoperative Mortalität und konsistente Herzphänotypen. Die Mäuse wurden durch Einatmen von Sauerstoff mit 4 % Isofluran in einer Kammer anästhesiert und während einer AB- oder Scheinoperation intubiert und beatmet, indem sie 2 % Isofluran einatmeten. Vor und nach der Operation wurden subkutane Injektionen von 0,3 mg/ml Buprenorphin (0,1 mg/kg) verabreicht. Den Tieren, die in den folgenden 24 Stunden Anzeichen von Schmerzen zeigten, wurden zusätzliche Analgetika verabreicht.

Die Echokardiographie wurde zu Studienbeginn sowie eine, drei und sechs Wochen nach AB durchgeführt. Die Tiere wurden in einer Kammer mit 4 % Isofluran betäubt und die Anästhesie wurde aufrechterhalten, indem 1–2 % Isofluran durch eine Maske eingeatmet wurden. Die Herzmaße wurden von einem blinden, erfahrenen Bediener mit dem Bildgebungssystem VEVO 2100 (VisualSonics, Toronto, Kanada) erfasst. Die Analyse der Echokardiographiebilder wurde genotypblind mit der Ultraschallanalysesoftware Vevo LAB (VisualSonics) durchgeführt.

Eine Magnetresonanztomographie (MRT) wurde zu Studienbeginn sowie eine und drei Wochen nach der AB durchgeführt. Die Tiere wurden in einer Kammer mit 4 % Isofluran anästhesiert und die Anästhesie wurde mit 1–2 % Isofluran aufrechterhalten. Die Akquisitionen waren prospektiv atmungsgesteuert und R-Peak-ausgelöst. Während der Untersuchung wurden Elektrokardiogramm (EKG), Atemfrequenz und Körpertemperatur überwacht. Die MRT-Aufnahme wurde mit einem 9,4-T-Magneten (Bruker, USA) mit einer 35-mm-Rapid-QUAD-Hochfrequenzspule durchgeführt. Es wurden ein 4-Kammer-Langachsen-CINE-Sequenzschnitt sowie ein Stapel von Kurzachsenschnitten, die den LV abdecken, aufgenommen. Die Bildgebungsparameter waren: Echokardiographiezeit = 1,7 ms (lange Achse) und 2,05 ms (kurze Achse), Wiederholungszeit = 5,0 ms (lange Achse) und 4,7 ms (kurze Achse), Sichtfeld = 25 mm× 25 mm, Matrix = 128 Pixel x 128 Pixel, Schichtdicke = 1,0 mm, Flipwinkel 15°, Signalmittelung = 3-fach, Gesamterfassungsdauer = 1–2 Minuten (lange Achse) und 6–10 Minuten (kurze Achse). ). Wir haben eine 4-Kammer-Langachsen- und eine mittelventrikuläre Kurzachsen-Gewebephasenkartierung (TPM) mithilfe von Compressed Sensing erfasst38. Die TPM-Parameter waren: Echokardiographiezeit = 1,7 ms, Wiederholungszeit = 3,5 ms, Sichtfeld = 25 mm × 25 mm, Matrix = 96 × 24 Pixel (4x Unterabtastung, 96 × 96 nach Rekonstruktion), Schichtdicke = 1 mm , Flipwinkel = 10°, für eine Gesamterfassungszeit von etwa 1,5–3 Minuten pro Schicht, abhängig von der Herzfrequenz. Die Analyse wurde blind mit hauseigenen MATLAB-Skripten durchgeführt, wie zuvor beschrieben39.

Die Tiere wurden in einer Kammer mit 5 % Isofluran betäubt, und schlagende Herzen und Lungen wurden den Tieren entnommen, die unter tiefer Endanästhesie 5 % Isofluran durch eine Maske atmeten. Die LVs wurden herausgeschnitten, in PBS gespült, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –70 ° C gelagert.

Herzen von AB- oder scheinoperierten Mäusen wurden in 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert und in Paraffin eingebettet. 7 μm große Paraffinschnitte wurden geschnitten und Adamtsl3-mRNA wurde mittels In-situ-Hybridisierung mit der RNAscope-Technologie (Advanced Cell Diagnostics, Kat. Nr. 465521) nachgewiesen. Zur Hybridisierung wurde ein HybEZ-Ofen und zur Visualisierung das 2,5 HD Red Detection Kit verwendet. Das Gewebe wurde mit Hämatoxylin gegengefärbt. Für die Bildgebung mit der Software Leica Application Suite v4.6 wurde ein Olympus BX51-Mikroskop (Olympus, Center Valley, PA) mit einer Leica DFC7000T-Kamera verwendet.

Schnappgefrorenes LV-Gewebe wurde in 4 % PFA fixiert und in Paraffin eingebettet. Mittelventrikuläre Schnitte mit einer Dicke von 7 µm wurden auf Superfrost Plus-Glasobjektträgern (Fisher) mit einem Leica RM2255-Mikrotom erstellt. Diese Objektträger wurden dann wie ausführlich beschrieben40 mit den Trichromfarben Picrosirius Red, Fast Green und Alcian Blue (RGB) gefärbt, um Kollagenprotein in den Schnitten sichtbar zu machen. Die Bilder wurden mit einem aufrechten Mikroskop Olympus BX51 mit einer Leica DFC7000T-Kamera und der Bildgebungssoftware Leica Application Suite v4.6 aufgenommen. Bereiche mit Kollagen wurden basierend auf Farbschwellenwerten automatisch aus RGB-Trichrome-Bildern durch ein benutzerdefiniertes Fiji ImageJ 1.53c (NIH, USA)-Makro erkannt, das den Prozentsatz der Fibrose berechnete. Das gleiche Makro wurde zu beiden Zeitpunkten auf alle Bilder beider Genotypen angewendet.

Die quantitative Analyse von Hydroxyprolin in Maus-LVs, einem Maß für den Kollagenproteingehalt, wurde mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit dem AccQ-Fluor-Kit (Kat.-Nr. WAT052880, Waters, MA, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. 15 mg Gewebe wurden in flüssigem Stickstoff homogenisiert, über Nacht in 6 M HCl bei 112 °C hydrolysiert, getrocknet und mit dem AccQ-Fluor-Boratpuffer (Waters) derivatisiert. Die Derivate wurden mittels Umkehrphasen-HPLC mit dem Ultimate 3000-System (Nerliens Meszansky, Oslo, Norwegen) getrennt und durch Fluoreszenzdetektion mit Hydroxyprolin-Standards (Fluka, Buchs SG, Schweiz) quantifiziert.

Unlösliches Kollagen in mittelventrikulären Abschnitten wurde mithilfe eines kolorimetrischen Schnellgrün-/Pikrosirius-Rot-Assays gemessen, indem lösliches Kollagen vom Gesamtkollagen abgezogen wurde. Das Gesamtkollagen wurde wie zuvor beschrieben gemessen41 und ein enzymatischer Sircol-basierter Assay (Biocolor, UK) wurde zur Quantifizierung des löslichen Kollagens42 verwendet. Die Kollagenvernetzung wurde als Verhältnis von unlöslichem und löslichem Kollagen berechnet. Alle Messungen wurden in zweifacher Ausfertigung von einem erfahrenen, genotypunabhängigen Forscher durchgeführt. Die Kollagenmenge wurde auf das Gesamtprotein normalisiert.

LV-Kardiomyozyten wurden wie zuvor beschrieben aus WT- und L3-KO-Mäusen isoliert. Kurz gesagt, frisch herausgeschnittene Herzen wurden in einem Langendorff-System mit konstantem Durchfluss durch die Aorta kanüliert und mit Isolationspuffer perfundiert, der (in mmol/l) enthielt: 130 NaCl, 5,4 KCl, 25 HEPES, 0,5 MgCl2, 0,4 NaH2PO4 und 22 Glucose, pH 7,40 , 37 °C. Nach dem Waschen wurden die Herzen durch Perfusion mit 2,0 mg/ml Typ-2-Kollagenase-Lösung (290 Einheiten/mg, Worthington Biomedical Corp., Lakewood, NJ, USA) 6 Minuten lang verdaut. Das LV wurde präpariert und mit 0,2 mg DNase (Worthington) und 250 µL BSA (40 mg/ml) geschüttelt. Die Zellen wurden durch ein 200-µm-Netz filtriert und abgesetzt. Das Pellet wurde zweimal gewaschen und der Ca2+-Gehalt wurde schrittweise auf 0,2 mM erhöht. Isolierte CMs wurden in einer Kammer auf einem inversen Mikroskop (Observer D1, Zeiss, Deutschland) plattiert und kontinuierlich mit Hepes Tyrode-Puffer (37 °C) überfundiert, der (in mmol/l) enthielt: 140 NaCl, 5,4 KCl, 1,8 CaCl2, 0,5 MgCl2, 5,0 Hepes, 5,5 Glucose, 0,4 NaH2PO4, pH 7,40. Während der Aufzeichnungen wurden die Zellen mit 1 Hz stimuliert. Sarkomerpositionen wurden mit einem 63 x/1,2 W Wasserobjektiv (Objective C-Apochromat, Zeiss, Deutschland) und einer Hochgeschwindigkeitskamera (Digitale CMOS-Kamera C11440-22CU, Hamamatsu, Japan) mit einer Bildrate von 2 ms aufgezeichnet. Einzelne Sarkomerkontraktionen wurden mit Image J (NIH), Clampfit (Axon Instruments) und benutzerdefinierten Python-Skripten analysiert. Kurz gesagt, Hellfeldbilder wurden invertiert und durch einen FFT-Bandpassfilter (Fast Fourier Transform) gefiltert. Eine Region mit 10–15 Sarkomeren wurde ausgewählt. Die Intensität jeder vertikalen Pixellinie wurde gemittelt und die Positionen der Z-Linie (Spitzenwert) wurden durch eine Anpassungskurve unter Verwendung parabolischer Funktionen ermittelt. Durch Subtrahieren benachbarter Z-Linien-Positionen wurden einzelne Sarkomerkontraktionen erhalten und auf Ruhe-SL normiert, um eine fraktionierte Verkürzung zu erhalten. Die Daten wurden über 10–15 Sarkomere in jeder Zelle und über 3 aufeinanderfolgende Kontraktionen gemittelt.

Primäre CMs (nrCM) und CFBs (nrCFB) neugeborener Ratten wurden wie zuvor beschrieben isoliert44. Kurz gesagt, es wurden schlagende Herzen von 1–3 Tage alten Wistar-Ratten (Janvier Labs) nach der Enthauptung entnommen. Die Ventrikel wurden herausgeschnitten und mit einer Pankreatin/Kollagenase-Lösung verdaut. Die adhärente Zellpopulation wurde von nicht adhärenten Zellen durch 20-minütige Anheftung an unbeschichtete Kulturflaschen isoliert. Laut Mikroskopie und qPCR-Analysen11 handelte es sich bei diesen Zellen hauptsächlich um CFBs. CFBs wurden eine Woche lang kultiviert, dann mit 3,8 × 104 Zellen/cm2 in Platten mit sechs Vertiefungen ausplattiert und vor der Ernte eine weitere Woche lang kultiviert. Die nicht gebundene Zellfraktion, hauptsächlich CMs, aber mit Anwesenheit von ECs11, wurde mit 3,8 × 104 Zellen/cm2 auf mit Gelatine und Fibronektin beschichteten Platten mit sechs Vertiefungen ausplattiert. Alle Zellen wurden in serumhaltigem Dulbecco's Modified Eagle-Medium (Gibco) in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 °C kultiviert. ADAMTSL3 wurde in neugeborenen Ratten-CFBs unter Verwendung eines replikationsdefizienten humanen Adenovirus-Serotyp-5-Vektors (Ad5 dE1/E3), der für ADAMTSL3 (Genbank RefSeq BC128389) kodiert, unter dem Cytomegalovirus (CMV)-Promotor (L3) oder einer Vehikelkontrolle (Ad5 dE1/E3) überexprimiert -CMV-Null) (Veh) (beide im Handel erhältlich von Vector Biolabs, PA, USA). Die Zellen wurden ausgesät und nach 24 Stunden (Tag 1) in einem 4-tägigen Kulturprotokoll (Abb. S5a) transduziert, in dem Zellen ein sich entwickelndes, unreifes ECM-Netzwerk ablagern11. Die Transduktion wurde in Wachstumsmedium mit einem Virustiter von 5 × 106 Plaque-bildenden Einheiten (PFU) durchgeführt, was eine Infektionsmultiplizität (MOI) von 100 ergab. Das Wachstumsmedium wurde 24 Stunden nach der Transduktion gegen serumfreies Medium ausgetauscht. Eine erfolgreiche Überexpression wurde durch erhöhte Adamtsl3-mRNA in L3- vs. Veh-Kontrollzellen verifiziert (Abb. S5b). Zur Stimulation mit IFN-γ wurden die Zellen 24 Stunden lang in serumfreiem Medium gezüchtet und 3 Stunden vor der Ernte wurden 5 ng/ml rekombinantes IFN-γ (Z03274, GenScript, NJ, USA) zugegeben.

Menschliche fetale Herzfibroblasten (hfCFBs) wurden von Cell Applications, Inc (Kat.-Nr. 306-05 f) erhalten und in Herzfibroblasten-Wachstumsmedium (Kat.-Nr. 316-500, Cell Applications) oder Fibroblasten-Basalmedium (Kat.-Nr. 115-500, Cell Applications), beide ergänzt mit 1 % Penicillin/Streptomycin, in einem mit 5 % CO2 befeuchteten Inkubator bei 37 °C. Sofern nicht anders angegeben, wurden die Zellen für Experimente mit 10.000 Zellen/cm2 ausplattiert. Es wurde ein einzigartiges hfCFB-Kulturprotokoll verwendet, bei dem die Zellen eine reife ECM entwickeln, einschließlich Komponenten des TGFβ-Systems, wie zuvor beschrieben11. Kurz gesagt, die Zellen wurden insgesamt sieben Tage lang kultiviert und am vierten Tag mit L3 oder Veh bei 5 × 106 PFU transduziert. Nach 24 Stunden wurde das Transduktionsmedium durch serumfreies Basalmedium ersetzt (Abb. S5c). Eine erfolgreiche Überexpression wurde durch erhöhte ADAMTSL3-mRNA in L3- vs. Veh-Kontrollzellen verifiziert (Abb. S5d).

Der Kollagen-Gel-Kontraktionstest wurde im Wesentlichen wie beschrieben11 durchgeführt. L3- oder Veh-transduzierte hfCFBs wurden trypsinisiert, zentrifugiert und in serumfreiem Medium resuspendiert. Die Zellen wurden mit einer Kollagenlösung, die 3 mg/ml Rinderkollagen I (Bovine PureCol®, Advanced BioMatrix), 2x DMEM (Merck Millipore) und 0,2 M HEPES (pH 8) enthielt, gemischt und mit 36,5 × 103 Zellen/cm2 in 24 Zellen ausplattiert -Well-Platten, vorbeschichtet mit 2 % BSA in PBS über Nacht bei 37 °C. Die Kollagengele polymerisierten 2 Stunden lang bei 37 °C und zur Ablösung der Gele wurde serumfreies Medium zugegeben. Der Umfang der Gele, der dem Ausmaß der Gelkontraktion entspricht, wurde 6 und 24 Stunden später mit ImageJ 1.53c (NIH) gemessen.

nrCFBs wurden in Platten mit 12 Vertiefungen ausgesät und nach 24 Stunden mit Veh oder L3 transduziert. Das Medium wurde nach 24 Stunden gegen serumfreies Medium mit 50 µM/ml Ascorbinsäure und 1 µCi L-[2,3-3H]-Prolin (Kat.-Nr. NET323001 MC, PerkinElmer, Inc, MA) ausgetauscht. Am 4. Tag wurden die Zellen mit kaltem PBS gewaschen, in 1 M NaOH lysiert und mit dem Flüssigszintillationscocktail OptiPhase HiSafe 3 (Kat.-Nr. 1200.437, PerkinElmer) verdünnt. Die in jeder Probe vorhandene Menge an radioaktiv markiertem Prolin als Ersatz für die Kollagenproteinbiosynthese45 wurde mit dem Flüssigszintillationszähler Wallac Winspectral 1414 (PerkinElmer) als Anzahl pro Minute (CPM) gemessen.

L3- oder Veh-transduzierte hfCFBs wurden mit 1000 Zellen/mm2 in 96-Well-Platten (Kat.-Nr. 6005430, Perkin Elmer) ausplattiert. Nach 24-stündigem Serummangel wurden die Zellen 2 Stunden lang mit 10 µM EdU markiert. Die Zellen wurden mit dem Click-iT™ EdU Proliferation Assay (Kat.-Nr. C10499, CyQUANT, Invitrogen) fixiert und die EdU-Fluoreszenz wurde auf dem Hidex Sense Microplate Reader (LabLogic Systems, Sheffield, UK) gemessen, im Wesentlichen wie beschrieben11.

Die Gesamt-RNA wurde mit dem RNeasy Mini Kit (Kat.-Nr. 74106, Qiagen Nordic, Norwegen) aus Herzgewebe oder kultivierten Zellen isoliert. Das iScript cDNA Synthesis Kit (Kat.-Nr. 1708891, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) wurde für die reverse Transkription und cDNA-Erzeugung aus isolierter RNA verwendet. Die relative Genexpression in jeder Probe wurde mithilfe von TaqMan-Genexpressionsassays (Tabelle SIII) und vorgefertigten TaqMan-Genexpressionsarrays für den TGFB-Signalweg (Kat.-Nr. 4414097) und menschlichen extrazellulären Matrix- und Adhäsionsmolekülen (Kat.-Nr. 4414133) mit dem TaqMan Universal PCR Master Mix bestimmt (Kat.-Nr. 4304437). Für die PCR-Amplifikation und -Detektion wurde das QuantStudio 3 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) verwendet.

Die RNA-Sequenzierung (RNA-seq) wurde an isoliertem LV-Gewebe aus WT- (n = 6) und L3-KO-Herzen (n = 10) eine Woche nach AB durchgeführt, ähnlich wie zuvor beschrieben46. Kurz gesagt, die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von TRI-Reagenz (Sigma Aldrich) durch Phenol-Chloroform-Extraktion isoliert. LV-Gewebe wurde in 1 ml TRI-Reagenz unter Verwendung des Tissuelyzer II (Qiagen) homogenisiert. Ribosomale RNA wurde mit dem NEBNext® rRNA Depletion Kit (Mensch/Maus/Ratte, New England Biolabs) entfernt. Gesamte gestrandete RNA-seq-Bibliotheken wurden unter Verwendung des CORALL Total RNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen) mit AMPure-Kügelchen (Beckman Coulter) zur Reinigung erstellt. Qualitätskontrolle der RNA-seq-Bibliotheken mit dem 2100 Bioanalyzer (Agilent). Die Qualitätskontrolle und Sequenzierung wurde in der Next Generation Sequencing-Einrichtung des Babraham Institute in Cambridge, Großbritannien, durchgeführt. RNA-seq-Bibliotheken wurden auf einer Spur des HiSeq2500 (Illumina) mit dem HiSeq2500-RapidRun 100 bp Single End-Sequenzierungslauf sequenziert. Die RNA-seq-Daten wurden mithilfe von HiSAT247 mit dem Mus musculus-Referenzgenom GRCm38/mm10 abgeglichen. Die Lesevorgänge wurden vor dem Alignment mit Trim Galore getrimmt, mit einem Phred-Qualitätswert für den Base-Calling-Cutoff von 20, was einem maximalen Fehler von 1 in 100 Basen entspricht, und mit einer maximalen Trimmfehlerrate von 0,1. Zugeschnittene und ausgerichtete Sequenzdateien wurden zur Visualisierung und Analyse als BAM-Dateien in SeqMonk (v1.42.0) importiert. RNA-seq-Reads wurden durch Quantifizierung der Read-Anzahl und globale Normalisierung quantifiziert, um die Gesamt-Read-Anzahl für jede Bibliothek zu ermitteln und als Reads pro Kilobase Million (RPKM) auszudrücken. Die Analyse auf differentiell exprimierte Gene (DEGs) wurde mit der R-basierten Software DESeq248 durchgeführt. Rohe (nicht logarithmisch transformierte) Lesezahlen wurden als Eingabe verwendet und eine globale Normalisierung auf die Gesamtgröße der Bibliothek durchgeführt.

Maus-Adamtsl3-Zellexpressionsdaten wurden aus der Single Cell Expression Atlas-Datenbank (https://www.ebi.ac.uk/gxa/sc/home), EMBL-EBI, Cambridgeshire, UK, abgerufen am 31.05.2022)22 erhalten. Humane ADAMTSL3-Expressionsdaten aus dem LAA und LV verstorbener Organspender wurden vom GTEx Project Portal (https://gtexportal.org/home), Broad Institute, Boston, MA, abgerufen am 31.05.2021, bezogen. Die Diagramme wurden von den interaktiven Grafikfunktionen der Datenbanken abgewandelt.

Proteine ​​wurden aus Herzgewebe von Menschen und Mäusen gemäß einem zuvor beschriebenen Protokoll20,44 mit einem PBS-basierten Lysepuffer extrahiert, der Triton X-100 (1 %), Tween-20 (0,1 %) und Proteaseinhibitoren (völlig EDTA-frei) enthielt Mini, Roche Diagnostics) und PhosStop-Phosphatasehemmer (Roche Diagnostics). Proteine ​​aus Zellkulturen wurden mit einem Lysepuffer extrahiert, der SDS (1 %) und Tris-HCl (31,5 mM, pH 6,8) enthielt. Proteinlysate wurden mit dem Branson Sonifier® S-150D (Emerson Electric Co. St. Louis, MO) beschallt, 20 Minuten bei 15.000 G zentrifugiert und der Überstand bei –70 °C gelagert. SDS-PAGE und Immunblotting wurden unter Verwendung von Criterion TGX-Gelen und Trans-Blot Turbo-Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen (Bio-Rad) auf dem Trans-Blot Turbo Semi-Dry-Blotting-System (Bio-Rad) durchgeführt. Die folgenden Antikörper wurden verwendet: Anti-Phospho-Smad2 (Ser465/467, Kat.-Nr. 3108, Cell Signaling), Anti-Smad2/3 (Kat.-Nr. 3102, 8685, Cell Signaling), beide 1:1000 in 5 % Milch verdünnt, Anti-TGFb (Ab92486, Abcam) 1:1000, 1 % Kasein, Anti-LAP (AF-246, R&D Systems) 1:1000 in 5 % Milch unter nicht reduzierenden Bedingungen, Anti-LTBP1 (Kat.-Nr. MAB-388, R&D Systems) 1:1000 in 5 %iger Milch unter nicht reduzierenden Bedingungen verdünnt, Anti-α-SMA (Kat.-Nr. A5228, Sigma), 1:10.000 in 5 %iger Milch verdünnt, Anti-OPN (Ab181440, Abcam) 1:1000 in 1 % Milch, Anti-GAPDH (Kat.-Nr. sc-32233, Santa Cruz Biotechnology), 1:1000 verdünnt in 5 % Milch, Anti-ADAMTSL3 (HPA034773, Atlas Antibodies) 1:1000 in 1 % Casein und Anti-ADAMTSL3 (in (Hauseigener polyklonaler Antikörper, hergestellt im Kaninchen) 1:1000 in 1 % Kasein. Es wurden Sekundärantikörper für Maus oder Kaninchen (1:2000, Santa Cruz Biotechnology) verwendet. Für den Sekundärantikörpernachweis wurde ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (Amersham) verwendet und das Gesamtprotein wurde mittels Revert 700-Proteinfärbung (Licor) nachgewiesen. Fluoreszenz oder Chemilumineszenz wurden mit dem Western-Blot-Bildgebungssystem Azure 600 (Azure Biosciences) abgebildet. Proteinbanden wurden mit ImageJ 1.53c (NIH) quantifiziert. Für die Berechnungen verwendete vollständige Western-Blot-Membranen sind in den Zusatzinformationen unter „Ergänzende Blots“ aufgeführt.

Statistische Unterschiede wurden mit Prism 8.3.0 (GraphPad) getestet. Die Daten werden mit Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Die Verteilung der Daten wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test ausgewertet. Beim Vergleich zweier normalverteilter Gruppen wurde der ungepaarte Student-t-Test angewendet. Beim Vergleich mehrerer Gruppen wurde eine einfache ANOVA mit den Mehrfachvergleichstests von Tukey oder Dunnett angewendet. Für den Vergleich mehrerer Zeitpunkte wurde die Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen und der Geisser-Greenhouse-Korrektur verwendet. Zum Vergleich der Überlebenskurven wurde der Log-Rank-Test (Mantel-Cox) durchgeführt. P-Werte <0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. P-Werte werden als exakte Werte angegeben, oder für Mausmodelldaten wird die Signifikanz als Symbole angegeben, die *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001 für AB vs. Schein und $p < darstellen 0,05, $$p < 0,01 und $$$p < 0,001 für L3-KO AB vs. WT AB. Für RNA-seq-Daten galten RPKM-Werte ≥ 1,0 als über dem Rauschen liegend und Gene mit ≥ 1,0 in vier oder mehr Proben galten in diesem Datensatz als nachweisbar. Es wurde eine Benjamini-Hochberg-Korrektur für Mehrfachtests und ein FDR von 0,05 verwendet. Die funktionale Anreicherungsanalyse für GO-Begriffe und KEGG-Pfade wurde im Analyseassistenten der Datenbank für Annotation, Visualisierung und integrierte Entdeckung (DAVID) v6.849 (abgerufen am 27.08.21) durchgeführt und IPA von Qiagen wurde für die Vorhersage vorgelagerter Regulatoren verwendet. Alle Zellkulturexperimente wurden mindestens dreimal durchgeführt, was drei biologischen Replikaten entspricht, d. h. Isolationsrunden für Primärzellen oder getrennte Aussaatzeitpunkte für menschliche fötale CFBs, wobei jedes Experiment zwei oder mehr technische Replikate umfasste. Die In-vivo-Mausexperimente wurden in drei separaten Kohorten durchgeführt. Zwei Kohorten wurden nach einer Woche und eine Kohorte nach sechs Wochen geerntet. Das n jedes Experiments ist in den jeweiligen Abbildungslegenden angegeben, wobei n = 3–12 in jeder Gruppe für jede Analyse.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die zur Erstellung der Diagramme und Diagramme in Abb. 3 verwendeten RNA-seq-Daten werden in Supplementary Data 1 hochgeladen und vollständig im European Nucleotide Archive (ENA, EMBL-EBI, Wellcome Genome Campus, Hinxton, Cambridgeshire, UK) hinterlegt ), Zugang: PRJEB47017. Alle numerischen Quelldaten, die zur Generierung der Hauptabbildungen verwendet wurden, werden in den Zusatzdaten 2 hochgeladen. Unbearbeitete Western-Blot-Bilder, die zur Generierung der Abbildungen verwendet wurden, werden in den Zusatzinformationen unter „Zusätzliche Blots“ aufgeführt. Alle weiteren Daten sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wurde vom norwegischen Forschungsrat unterstützt; Anders-Jahres-Fonds zur Förderung der Wissenschaft; die südöstliche regionale Gesundheitsbehörde; die Kristian Gerhard Jebsen Stiftung; Interne strategische Forschungsstipendien des Universitätsklinikums Akershus; die Blix-Stiftung zur Förderung der medizinischen Forschung; und der Olav Raagholt und Gerd Meidel Raagholts Fund for Science, Norwegen an [IGL]; das Allen Distinguished Investigator Program, durch Unterstützung der Paul G. Allen Frontiers Group, der Marfan Foundation und der American Heart Association an [SSA]; eine Auszeichnung des Dutch Heart Foundation Young Talent Program der Niederländischen Initiative für kardiovaskuläre Forschung (CVON), RECONNECT-Konsortien [ELR]; die niederländische Herz-Kreislauf-Allianz, CVON She-PREDICTS, Zuschuss 2017-21, Double Dosis, 2020-B005, FWO G091018N und FWO G0B5930N an [SH]; und das Institute of Health Carlos III (ISCIII) (PI18/01469, PI21/00946 und CB16/11/00483), Projekte, die vom Europäischen Fonds für regionale Entwicklung an [AG] kofinanziert werden. Wir danken Almira Hasic und Dina Behmen vom Institut für experimentelle medizinische Forschung und den Mitarbeitern der Tierstation KPM Ullevål am Universitätsklinikum Oslo für die hervorragende technische Unterstützung.

Institut für experimentelle medizinische Forschung, Universitätsklinikum Oslo und Universität Oslo, Oslo, Norwegen

Karoline B. Rypdal, A. Olav Melleby, Jia Li, Sheryl Palmero, Kristine Andreassen, Ivar Sjaastad, Theis Tønnessen, Mathis K. Stokke, William E. Louch, Geir Christensen und Ida G. Lunde

Abteilung für Diagnostik und Technologie, Universitätskrankenhaus Akershus, Lørenskog, Norwegen

Karoline B. Rypdal und Ida G. Lunde

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A. Olav Melleby

Abteilung für Kardiologie, Universität Maastricht, CARIM-Schule für Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Maastricht, Niederlande

Emma L. Robinson & Stephane Heymans

Abteilung für Biomedizintechnik, Cleveland Clinic Lerner Research Institute, Cleveland, OH, USA

Deborah E. Seifert, Daniel Martin, Catelyn Clark und Suneel S. Apte

Programm für Herz-Kreislauf-Erkrankungen, CIMA Universität Navarra und IdiSNA, Pamplona, ​​​​Spanien

Begoña López & Arantxa González

CIBERCV, Carlos III Institut für Gesundheit, Madrid, Spanien

Begoña López & Arantxa González

Abteilung für Kardiologie, Universitätsklinikum Oslo Rikshospitalet, Oslo, Norwegen

Christen P. Dahl

Abteilung für Herz-Thorax-Chirurgie, Universitätsklinikum Oslo Ullevål, Oslo, Norwegen

Theis Tønessen

Zentrum für Molekular- und Gefäßbiologie, Abteilung für Herz-Kreislauf-Wissenschaften, Leuven, Belgien

Stephane Heymans

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Konzeptualisierung und Studiendesign: KBR, AOM, SSA, GC, IGL Datenerfassung: KBR, AOM, ELR, BL, CC, JL, DES, DM, SP, KA, CPD, IS, TT, IGL Datenanalyse und Interpretation: KBR , AOM, ELR, AG, JL, DM, KA, MKS, WEL, SH, SSA, IGL Manuskriptentwurf: KBR, IGL Kritische Überarbeitung: Alle Autoren haben die endgültige Version des Manuskripts genehmigt und erklären sich damit einverstanden, für alle Aspekte verantwortlich zu sein die Arbeit.

Korrespondenz mit Karoline B. Rypdal.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteurin: Eve Rogers.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Rypdal, KB, Olav Melleby, A., Robinson, EL et al. ADAMTSL3-Knockout-Mäuse entwickeln nach Drucküberlastung eine Herzfunktionsstörung und -dilatation mit erhöhtem TGFβ-Signal. Commun Biol 5, 1392 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04361-1

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Eingegangen: 01. Januar 2022

Angenommen: 09. Dezember 2022

Veröffentlicht: 20. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04361-1

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