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Sep 10, 2023

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Wissenschaftliche Berichte Band 12,

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 10859 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die Stuhlanalyse bietet eine einfache, nicht-invasive Überwachung vieler Magen-Darm-Erkrankungen und Zugang zum Darmmikrobiom. Die Einhaltung der Protokolle zur Stuhlprobenahme bleibt jedoch aufgrund der vorherrschenden Abneigung gegen den Umgang mit dem Stuhl eine große Herausforderung. Wir stellen eine Technologie vor, die die Sammlung individueller Stuhlproben aus Toilettenabwasser für Stuhlprotein- und molekulare Tests ermöglicht. Menschliche Stuhlproben und eine in eine kommerzielle Toilette integrierte Tischtestplattform wurden verwendet, um eine zuverlässige Probensammlung über einen weiten Bereich von Stuhlkonsistenzen durch Fest-Flüssig-Trennung und anschließende Sprüherosion zu demonstrieren. Die erhaltenen Stuhlsuspensionen wurden zur Durchführung von Tests auf okkultes Blut zur Früherkennung von Magen-Darm-Krebs und zur Mikrobiom-16S-rRNA-Analyse verwendet. Unter Verwendung von Testkits für okkultes Blut zu Hause fanden wir insgesamt eine Übereinstimmung von 90 % mit der Standardprobenahme, eine Sensitivität von 96 % und eine Spezifität von 86 %. Die Mikrobiomanalyse ergab keinen signifikanten Unterschied in der Artenvielfalt innerhalb der Probe im Vergleich zur Standardprobenahme, und die Kreuzkontamination der Proben lag unter der Nachweisgrenze des Tests. Darüber hinaus berichten wir über die Verwendung eines analogen Trübungssensors zur Echtzeitbewertung von weichem Stuhl zur Verfolgung von Durchfall. Die Implementierung dieser Technologie in Wohneinrichtungen wird die Qualität der GI-Gesundheitsversorgung verbessern, indem sie die Einhaltung der routinemäßigen Stuhlüberwachung erleichtert.

Die nichtinvasive individuelle Gesundheitsüberwachung durch Smartphones, Wearables und Heimsensoren bietet die Vorteile einer objektiven und häufigeren Datenerfassung, den Komfort einer Fernüberwachung und verspricht die Integration dieser Daten in aussagekräftige klinische Beurteilungen des Krankheitsverlaufs und des Ansprechens auf die Behandlung1,2. Es besteht ein wachsendes Interesse an der Fernüberwachung der Gesundheit in der Magen-Darm-Medizin (GI) für weit verbreitete Erkrankungen wie funktionelle GI-Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen und Darmkrebs3,4. Diese Erkrankungen betreffen schätzungsweise bis zu 1 von 10 Menschen weltweit und wirken sich erheblich auf die Lebensqualität, die Arbeitsfähigkeit sowie die Gesundheitskosten aus5,6,7,8.

Stuhl, der traditionell nicht ausreichend genutzt wird, ist eine attraktive biologische Probe für die Fernüberwachung von Magen-Darm-Erkrankungen, da er nicht-invasiv und in Längsrichtung gesammelt werden kann. Die stuhlbasierte biochemische Analyse ist weniger invasiv und kostspielig als eine Koloskopie und ermöglicht die Erkennung vieler akuter und chronischer Magen-Darm-Erkrankungen wie Magen-Darm-Krebs9,10, Darminfektionen wie Clostridium difficile11, Ansprechen auf die Behandlung bei entzündlichen Darmerkrankungen12,13 und Glutenkonsum von Zöliakiepatienten14. Zusätzlich zur Diagnose von Krankheiten ermöglicht der Zugang zu Stuhlproben in Verbindung mit molekularer Analyse und Sequenzierung die Analyse des Darmmikrobioms und die Suche nach neuen Erkenntnissen über die Ätiologie von Krankheiten sowie nach neuen Therapieansätzen bei einer Reihe von intestinalen und extraintestinalen Erkrankungen15. 16,17,18. Eine zeitdichte Stuhlanalyse für die Zusammensetzung der Mikrobiota könnte eine Möglichkeit bieten, die Auswirkung der Pathophysiologie auf Umweltfaktoren wie Ernährungsgewohnheiten, medikamentöse Behandlungen und Darmmotilität zu erkennen19.

Obwohl sie nicht-invasiv und effektiv ist, ist die Umsetzung der stuhlbasierten Analyse in der Praxis stark eingeschränkt: Patienten sind selten in der Lage, während der klinischen Begegnung20,22,23,24,25,26,27 und einer Reihe von Studien eine Stuhlprobe zu entnehmen aus verschiedenen Regionen haben eine geringe Akzeptanz und Einhaltung der Überwachung von Magen-Darm-Erkrankungen auf der Grundlage regelmäßiger Stuhltests festgestellt20,21,22,23,24. Studien, die Hindernisse bei der Überwachung durch Stuhltests untersuchen, haben ergeben, dass Bluttests dem Stuhltest vorzuziehen sind, und legen nahe, dass wahrscheinlich nur Patienten mit aktiver Erkrankung einem Stuhltest zustimmen20,25. Überwachungsstudien, die bei stabilen Patienten durchgeführt wurden, ergaben durchweg eine Adhärenz von nur 30 % bei der Durchführung von vier oder mehr wiederholten Stuhltests21,22,26. Umfragestudien haben gezeigt, dass Vermeidung/Vergesslichkeit ein Hauptgrund für die schlechte Compliance bei wiederholten Stuhluntersuchungen ist27,28 und über 60 % der Befragten gaben an, dass der Grund für die geringe Akzeptanz von Stuhluntersuchungen Ekel/Verlegenheit bei der Stuhlentnahme war23,25,29.

Kürzlich wurden Ansätze vorgeschlagen, um stuhlbasierte Daten besser zu nutzen und die Stuhlanalyse in den routinemäßigen Toilettengebrauch zu integrieren30,31. Neue Bemühungen von Wissenschaftlern und Toilettenherstellern zur Überwachung von Ausscheidungen innerhalb und um eine Toilette herum konzentrierten sich auf die Analyse von Urin31,32,33,34,35,36,37.

Der Zugang zu Stuhlproben ist aufgrund der extrem klebrigen Beschaffenheit des Materials und seiner Heterogenität technisch anspruchsvoll38,39. Es wurde vorgeschlagen, Bilder des Stuhls in der Toilettenschüssel aufzunehmen, entweder durch den Benutzer40 oder ohne Benutzereingriff durch eine Kamera im Toilettensitz31, um die Merkmale des Aussehens des Stuhls zu verfolgen, da erhebliche Unterschiede zwischen der Beurteilung des Patienten und den Stuhleigenschaften, insbesondere der Konsistenz, berichtet wurden gegen Durchfall41,42,43. Der Betrieb einer Kamera im Badezimmer und insbesondere im Toilettensitz ist jedoch mit großen gesellschaftlichen Tabus und Datenschutzbedenken verbunden.

Hier berichten wir über einen Ansatz zur Isolierung menschlicher Fäkalien direkt hinter einer Spültoilette, die speziell für die Probenentnahme und -analyse konzipiert ist. Abwasser wird seit vielen Jahren für die molekularanalytische Überwachung von Infektionskrankheiten auf Gemeindeebene bei Polio44 verwendet und seit 2020 wird es in großem Umfang zum Nachweis von SARS-CoV-2 verwendet, um die Prävalenz von COVID-19-Infektionen auf Gemeindeebene zu bewerten Gemeindeebene45,46,47,48,49,50,51. In unserem Ansatz haben wir versucht, die Auflösung der abwasserbasierten Analyse auf das Niveau einer einzelnen Toilette und des einzelnen Stuhls, der durch diese gespült wird, zu verbessern. Der Zweck dieser Technologie besteht darin, den Prozess der Stuhlprobenahme automatisch und nahtlos in die tägliche Routine zu integrieren, um die Einhaltung eines Testplans zu verbessern, der ein besseres Krankheitsmanagement und bessere Ergebnisse ermöglicht.

Diese Arbeit präsentiert eine Proof-of-Concept-Demonstration der freihändigen menschlichen Stuhlsammlung zur kontinuierlichen Gesundheitsüberwachung. Der Ansatz trennt den Stuhl vom Abwasser, nachdem die Toilette zum Zweck der Analyse gespült wurde. Mithilfe einer auf Puffersprüherosion basierenden Methode wird ein kleiner Teil des Stuhls für die biochemische Analyse auf eine Weise gesammelt, die sich automatisieren lässt und Kreuzkontaminationsprobleme bewältigt. Zwei Arten physiologisch relevanter Daten, Messungen des okkulten Blutes und 16S-rRNA-Mikrobiomanalyse, wurden an Stuhlproben durchgeführt, die aus unserem Prototypsystem entnommen wurden. Die analytische Integrität der Ergebnisse wurde durch einen paarweisen Vergleich mit konventionell entnommenen Stuhlproben beurteilt. Für die klinisch relevanten Fälle von wässrigem und lockerem Stuhl demonstrieren wir einen analogen Inline-Trübungssensor mit der Fähigkeit, losen Stuhl von anderen Arten von Abwasser zu unterscheiden und so Durchfall zu verfolgen.

Ein grundlegendes Designkriterium für unseren Ansatz ist die nahtlose Integration der Stuhlanalyse in die routinemäßige Benutzung der Toilette, ohne dass beim Benutzer Maßnahmen oder Gewohnheitsänderungen erforderlich sind oder Unbehagen entsteht. Dieses Kriterium minimiert Hindernisse für die Einführung und erhöht die Wahrscheinlichkeit einer langfristigen Verwendung für die Längsschnittdatenerfassung. Wir haben dieses Ziel erreicht, indem wir das Aussehen und die Funktion der Toilettenschüssel unverändert ließen und indem wir in den Rohrleitungen arbeiteten, wo die Probenahme und Analyse außerhalb des Einflussbereichs des Benutzers erfolgt, nachdem die Probe die Schüssel verlassen hat.

Eine weitere wichtige Voraussetzung ist die Möglichkeit, eine vom Toilettenbenutzer unabhängige und automatisierbare Stuhlprobe zu entnehmen.

Um als Instrument zur Gesundheitsüberwachung wertvoll zu sein, muss das System in der Lage sein, das gesamte klinische Spektrum an Stuhlkonsistenzen von Verstopfung bis hin zu weichem Stuhl zu erkennen. Ein weit verbreitetes medizinisches Standarddiagnoseinstrument zur Kategorisierung des Stuhls von Erwachsenen anhand seines Erscheinungsbilds ist die Bristol Stool Form Scale (BSFS)38,39, die 7 Typen umfasst, die von BSFS 1 (separate harte Klumpen, wie Nüsse) bis BSFS 7 (wässrig, keine festen Stücke).

Eine Standard-Spültoilette besteht aus einer Schüssel, die menschliche Ausscheidungen entsorgt, indem sie mit Wasser durch ein Abflussrohr an einen anderen Ort zur Entsorgung gespült wird. Von entscheidender Bedeutung für dieses Design ist ein U-förmiger Abschnitt des Auslassrohrs, der das Wasser aufnimmt – ein so genannter P- oder S-Falle –, der als Dichtung fungiert und verhindert, dass schädliche Gase durch die Toilette in das Badezimmer aufsteigen. Unser Design fängt Fäkalien mithilfe einer Vorrichtung auf, die in die Leitungen am Ausgang der Toilette nach dem Siphon integriert ist (Abb. 1), um die geruchsdichten Eigenschaften der Toilette zu bewahren. Die reversible Immobilisierung des gesamten Stuhls wurde durch Fest-Flüssig-Trennung erreicht und durch Einspülen des Stuhls in einen Tischprüfstand nachgewiesen (Abb. 1A–C). Die Immobilisierung wurde durch eine Kombination aus Strömungstransportkräften und Okklusion durch einen Absperrschieber V1 erreicht (Abb. 1D). Als V1 geschlossen wurde, transportierte die Trägheit feste Abfälle in eine 3D-gedruckte, speziell angefertigte Komponente, die von V1 verschlossen wurde; Wasser wird durch Ventil V2 und durch Ventil V3 an einem Umleitungsrohr abgelassen. Der Stuhl war in der Nähe der Klappe V2 immobilisiert und hatte normalerweise keinen Kontakt mit der verschließenden Klappe V1. Der Großteil des Wassers floss durch Ventil V3 ab, wodurch sichergestellt wurde, dass die Schüssel mit einer ähnlichen Geschwindigkeit wie bei einer normalen Spülung geleert wurde. Wir stellten fest, dass der Stuhl bei mindestens 90 % der Tests (Abb. 2A) in beiden Toilettentypen im Bereich in der Nähe von Ventil V2 immobilisiert und mit der Probenahmeöffnung ausgerichtet war (90 Spülungen für die Toilette mit hinterem Ausgang und 40 für den unteren Ausgang). Toilette); in den übrigen Fällen war der Stuhl typischerweise zwischen Klappe V2 und Klappe V1 immobilisiert. Sobald der Stuhl ruhig gestellt und das Wasser abgelassen war, wurde über eine Öffnung mit einer wasserdichten Inspektionskamera (Depstech-Endoskop mit 6 LED-Beleuchtung) ein Stuhlbild aufgenommen (Abb. 2B). Solche Bilder einzelner Stuhlproben eignen sich gut für die genaue Bestimmung der Stuhlmorphologie durch maschinelles Lernen, wie einige dieser Forscher zuvor berichtet haben52.

(A) Eine Abbildung des Prototyps, der an eine Hinterausgangstoilette angeschlossen ist. (B) Nahaufnahme des unteren Teils des in (A) gezeigten Prototyps. (C) Bild des Prototyps, der an eine Toilette mit Bodenausgang angeschlossen ist, wobei das Endoskop zur Bilderfassung an einen Laptop angeschlossen ist. (D) Funktionsprinzip des Systems einschließlich 4 Ventilen, V1 bis V4, und I = Inspektions- und Entlüftungsanschluss. 1. Die Ventilposition für den regulären Betrieb der Toilette. Der blaue Pfeil zeigt die Spülrichtung des Wassers von der Toilette zur Abwasserleitung an. 2. Der Stuhl wird im Stuhlbereich (rot gestricheltes Rechteck) fixiert. 3. Ein Puffersprühstrahl erodiert die Probe, die durch Schwerkraft durch V4 gesammelt wurde. 4. Der Stuhl wird in die Kanalisation gespült.

(A) Immobilisierungseffizienz gemessen mit geformten Leihmüttern und menschlichen Stühlen in Toiletten mit Hinterausgang und Unterausgang. (B) In-situ-Bild des immobilisierten menschlichen Stuhls im Prototyp. (C) Bild einer durch Sprüherosion extrahierten Stuhlprobe. (D) Effizienz der Stuhlentfernung aus der Immobilisierungsregion mit einer Toilettenspülung. (E) Bakterienzählung anhand der wahrscheinlichsten Anzahl (MPN) für Stuhlproben unterschiedlicher Konsistenz (BSFS-Typ) zur Probenextraktion und nach der Stuhlentfernung und der Implementierung des Clean-in-Place-Verfahrens.

Eine Probe wurde mithilfe eines Hochdruckflüssigkeitsstrahls extrahiert, um einen Teil des immobilisierten Stuhls zu erodieren und aufzulösen (Abb. 2C). Die vom Puffer erodierte Flüssigkeitsprobe wurde durch Schwerkraft durch ein totraumfreies Ventil V4 gesammelt (Einzelheiten im Abschnitt „Probenentnahme“) (Abb. 1D, Schritt 3).

Als letzten Schritt der Operation wurde der Rest des Stuhls durch eine zweite Spülung in die Kanalisation entsorgt, während die Verstopfung des Ventils V1 entfernt und alle anderen Ventile geschlossen wurden. Die Entfernung wurde in 90–100 % der Tests mit einer einzigen Spülung erreicht (Abb. 2D).

Ein Hauptanliegen bei der Probenahme eines klebrigen Materials wie Fäkalien besteht darin, eine minimale Kreuzkontamination zwischen den Proben sicherzustellen. Unser Entwurf beinhaltete ein Probenahmeventil ohne Totvolumen, um stagnierendes Volumen oder hervorstehende Oberflächen zu beseitigen. Auch im Toilettenbetrieb nutzten wir die Verfügbarkeit von Leitungswasser zum Spülen von Oberflächen. Um das Ausmaß der Kontamination von Probe zu Probe bei der Stuhlimmobilisierung zu bestimmen, haben wir fäkale coliforme Bakterien gemessen, die natürlicherweise im Stuhl vorkommen.

Fäkale Bakterien wurden mithilfe einer Methode der wahrscheinlichsten Zahl (MPN) an Proben eines 3D-gedruckten ABS-Geräts quantifiziert. Der MPN-Assay wurde an extrahierten Stuhlproben und Proben aus Leerspülungen nach der Stuhlentsorgungsspülung durchgeführt. Die Bakterienkonzentration war in den Proben erwartungsgemäß hoch (> 104 MPN/ml) (Abb. 2E). Die nach der Entsorgungsspülung gesammelte Probe enthielt einen stark reduzierten Bakteriengehalt, der um 1 bis 3 log reduziert war, was wahrscheinlich damit zusammenhängt, wie „sauber“ die Probe entnommen wurde. Das Clean-in-Place-Verfahren bestand in dieser Studie aus einer zweiten Spülung. Wir haben Proben unterschiedlicher Konsistenz getestet [Wert von BSFS 3 (wurstförmig) bis BSFS 6 (breiig)] und für diese Tests war diese Spülung ausreichend, damit das extrahierte Volumen zu einem Bakteriengehalt unterhalb der Nachweisgrenze des Tests führte (3). MPN/ml).

Bei der Standardprobenahme für Stuhltests führt eine Person einen gerillten Stab oder Spatel in mehrere Bereiche des Stuhls ein und verdünnt die Probe sofort in Puffer (Abb. 3). Es ist schwierig, diesen Prozess in einer Abwasserinstallationsumgebung zu automatisieren, da für jede Messung ein neuer Stab erforderlich ist, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.

Probenahmestudie. Standardprobenahme: (A) Verfahrensdarstellung des Herstellers. (B) Verteilung der gesamten nassen Feststoffe mit einem Medianwert von 8 mg/ml. (C) Durchschnitt und Standardabweichung der Gesamtfeststoffe einzelner Proben, n = 3 bis 5 für jede Probe. BS2 = Bristol Stool Form Scale 2 weist auf klumpigen Stuhl mit harter Konsistenz hin. Prototypenbemusterung (D): Schematisch. (E) Verteilung der gesamten vom Prototyp gesammelten Nassfeststoffe. (F) Gesamtfeststoffe, die aus einzelnen Proben mit einer Sprühzeit von 5 s bei dem angegebenen Druck extrahiert wurden.

Wir schlagen einen neuartigen Probenahmeansatz vor, der sich leicht in Sanitär- und Automatisierungstechnik umsetzen lässt und auf den spezifischen Eigenschaften von Fäkalien basiert. Der Wassergehalt des gebildeten Kots beträgt durchschnittlich 75 %53, was im Gegensatz zu typischem Pastenmaterial einen hohen Wert darstellt. Beispielsweise wurde bei dem in diesen Tests verwendeten Sojabohnenersatz ein Wassergehalt von 54 % gemessen, während der durchschnittliche Wassergehalt bei wässrigem Stuhl bei Durchfall bei 88 % liegt54. Der hohe Wassergehalt des Stuhls deutete darauf hin, dass die Zugabe einer kleinen Menge Flüssigkeit ausreichte, um den festen Stuhl in eine Flüssigkeit umzuwandeln, die leichter zu handhaben und weniger klebrig ist.

Die Stuhlprobenentnahme in unserem Design beruhte auf einem Puffersprühstrahl, um den Stuhl zu erodieren, und auf dem Sammeln der verflüssigten Probe durch Schwerkraft durch eine Ventilöffnung. Die Vorteile dieses Ansatzes sind vielfältig: Keine mechanischen Teile im Rohr, leicht automatisierbar (Sprüh- und Ventilsystem) und einfache Reinigung. Wir gingen davon aus, dass dieser Ansatz eine für die biochemische Analyse geeignete Probe liefern würde, da die Verdünnung in Puffer der erste Schritt der meisten Stuhltests ist.

Stuhltests erfordern eine kleine Stuhlmenge (ca. Zehntel mg) und tolerieren häufig eine Reihe von Werten. Der feuchte Gesamtfeststoffgehalt in mg/ml ist ein Maß für die Verdünnung der Feststoffmenge im Puffer. Molekulare Tests zum Nachweis von Krankheitserregern im Stuhl empfehlen eine Masse von 50–200 mg (siehe SI), was zu 20–100 mg/ml feuchter Feststoffe führt, während Tests für häufiger vorkommende Arten wie das Mikrobiom eine vage „kleine“ Stuhlmenge erfordern. Um die Stuhlmenge für einen Point-of-Care-Test (POC) zu bestimmen, haben wir die vom Stäbchen gesammelte Feststoffmenge in einem kommerziellen Heimtest auf okkultes Blut gemessen (Abb. 3A). Abbildung 3B zeigt die Ergebnisse des Feststoffgehalts, die mithilfe einer Standardprobenahme von 18 Stühlen ermittelt wurden, und veranschaulicht einen breiten Wertebereich mit einem Median von 8 mg/ml, einem Durchschnitt von 11 mg/ml und einer Standardabweichung von 12 mg/ml. Die Heterogenität der Stuhlform (BSFS 2–6 wurden gemessen) ist für einen Teil dieser Variabilität verantwortlich; Abb. 3C zeigt jedoch, dass wiederholte Messungen an denselben Stuhlproben zu einer großen Variation führten (CoV zwischen 0,2 und 0,7). Die Leistung unseres vorgeschlagenen Extraktionsansatzes (Abb. 3D) wurde mithilfe eines benutzerdefinierten Aufbaus mit einer Pumpe mit einstellbarer Durchflussrate und Verbindung zu einer Präzisionsdüse bewertet.

Wir haben die Menge an Feststoff untersucht, die durch Sprüherosion extrahiert werden soll. Die Messungen wurden bei mehreren Durchflussraten (zwischen 0,4 und 1,1 l/min, entsprechend Drücken zwischen 3,6 und 30 psi, gemäß den Düsenspezifikationen) und unterschiedlichen Sprühzeiten (2 s, 5 s, 10 s) durchgeführt. Wir haben sprüherodierte Proben in Fläschchen gesammelt und den Gesamtfeststoffgehalt durch Trocknen wie in den Methoden beschrieben bestimmt.

Abbildung 3E zeigt, dass wir durch Sprüherosion ein breites Spektrum an feuchten Feststoffen von wenigen mg/ml bis 60 mg/ml sammeln konnten, wobei das Histogramm einen breiten Bereich zeigt, der den Bereich der Standardprobenahme durch Verwendung unterschiedlicher Durchflussraten und Sprühzeiten vollständig abdeckt . Um sicherzustellen, dass dieser Ansatz die Entnahme ausreichender Stuhlprobenlösungen aus hartem Stuhl (BSFS 2) ermöglicht, haben wir gezeigt, dass 10 psi Werte von 2–5 mg/ml ergeben, vergleichbar mit der Standardmethode. Durch die Erhöhung auf 30 psi erhielten wir über 20 mg/ml Feststoffe. Für diese Studie standen keine BSFS 1-Stühle mit harten Klumpen zur Verfügung, aber diese Daten und die Möglichkeit, den Druck zu erhöhen, legen nahe, dass die Sprüherosion so eingestellt werden kann, dass Proben aus dem gesamten Bereich der Stuhlkonsistenz erhalten werden. Für weicheren Stuhl war ein Druck von 3,6 psi am besten geeignet, um einen Bereich von 10–20 mg/ml zu erhalten, vergleichbar mit der mittleren Konzentration von 8 mg/ml, die bei der Standardprobenahme erhalten wurde (Abb. 3F).

Um die Machbarkeit der Messung eines Protein-Biomarkers für GI-Erkrankungen anhand von Stuhlproben zu demonstrieren, die aus dem Prototyp mit Sprüherosion gewonnen wurden, haben wir den bewährten Lateral Flow Assay (LFA) Fecal Immunochemical Test (FIT) zur Messung von okkultem Blut ausgewählt. Der fäkale immunchemische Test (FIT) für okkultes Blut basiert auf dem Nachweis von menschlichem Hämoglobin und erfordert keine Einschränkungen bei der Nahrungs- oder Medikamenteneinnahme. Der FIT-Test zeichnet sich durch eine gute Sensitivität und ausgezeichnete Spezifität für Magen-Darm-Krebs aus55 und wird weltweit und von der American Cancer Society als jährliches Screening für Personen ab 45 Jahren empfohlen, bei denen regelmäßig ein Risiko für Magen-Darm-Krebs besteht9,10,56.

Gesunder Stuhl ist negativ für okkultes Blut und kann mit menschlichem Hämoglobin versetzt werden, um ein positives Ergebnis zu erhalten, wie dies bei Eignungstests dieser Kits durchgeführt wurde57. Zahlreiche CLIA-gekennzeichnete FIT-Lateral-Flow-Assay-Kits der FDA für den Heimgebrauch sind mit qualitativer (positiver/negativer) Ausgabe erhältlich. Unsere Studie bewertete die Marken Pinnacle und Accutest57. Beide Tests verfügen über ein Probenahmeset und eine Kartusche mit einem immunchromatographischen Streifen zum Ablesen (Abb. 4A). Das Probenahmeset ist ein kleines Fläschchen mit einigen wenigen ml Puffer (3 ml für Pinnacle, 2,5 ml für Accutest) und einer Kappe, die an einem gerillten Kunststoffstab zur Stuhlsammlung befestigt ist. Nachdem der Benutzer das gerillte Stäbchen eine vorgeschriebene Anzahl von Malen (sechs Mal) in den Stuhl eingeführt hat, steckt er das gerillte Stäbchen wieder in das Fläschchen und schüttelt es, um den Stuhl im Puffer aufzulösen. Das Kit-Fläschchen hat einen kleineren Verschluss, um eine vorgeschriebene Anzahl Tropfen Stuhllösung in die Kartusche zu geben. Innerhalb von 5 Minuten nach dem Auftragen der Lösung erscheint die Kontrolllinie der Kartusche und bei Vorhandensein von Hämoglobin (Hb) erscheint die Farbe der Testlinie (Suppl. Abb. S1).

Auswirkung der Standard- und Prototypenprobenahme auf den Test auf okkultes Blut zu Hause. (A) Bild des Kits für zu Hause (Pinnacle), einschließlich eines Röhrchens mit Puffer, eines Schraubdeckels und eines gerillten Stabs zur Probenentnahme sowie einer Kartusche zum Ablesen der Ergebnisse. (B,C) Die Positivitätsrate (Prozentsatz der positiven Tests) der Marke (B) Pinnacle und (C) der Marke Accutest für menschlichen Stuhl stieg bei unterschiedlichen Hämoglobinkonzentrationen (Hb) stark an. Schwarzer Pfeil: nominelle Nachweisgrenze des Tests. Die Zahlen auf der zweiten horizontalen Achse geben die Anzahl der Wiederholungen an. (D) Die Übereinstimmungsmatrix für den paarweisen Vergleich derselben Proben bei einer Hb-Konzentration über dem Grenzwert (10 ng/mg für die Marke Pinnacle, 75 ng/ml für Accutest).

Die Hb-Nachweisgrenze wird vom Hersteller festgelegt und liegt typischerweise bei 50 ng/ml. Die Hb-Nachweisgrenze, ausgedrückt in ng Hb pro mg Stuhl, wird für Pinnacle mit 6 ng/mg und für Accutest mit 50 ng/mg angegeben.

Wir haben die nominale Empfindlichkeit des Kits verglichen, indem wir einen Bereich der Hb-Spitzenkonzentration getestet haben, der einen Bereich über und bis zum nominalen Schwellenwert abdeckt. Unter Verwendung von PBS als Erosionspuffer erhielten wir durch Sprüherosion Proben mit einem Nassfeststoffgehalt im Bereich von 5 bis 25 mg/ml und trugen ein den Tropfen entsprechendes Volumen (75 μl) auf die Kartusche auf (Suppl. Abb. S1). Abbildung 4B zeigt eine Empfindlichkeitskurve für Standardproben mit 100 % positiven Messwerten (n = 18) bei 10 ng/mg Hb, einem Wert über dem nominalen Empfindlichkeitsgrenzwert, und 4 % (n = 26) positiven Messwerten für nicht aufgestockte Proben. Die Messwerte der Patronenproben des Prototyps waren ähnlich, mit 100 % positiven Messwerten über der Nachweisgrenze und 7 % positiven Messwerten für nicht aufgestockte Proben. Eine ähnliche Studie wurde mit dem Accutest-Assay unter Verwendung von 100 μl Suspension (Abb. 4C) durchgeführt, um den Fall zu untermauern, dass die Prototyp-Probenahme die gleiche analytische Nachweiskonzentration wie die Standard-Probenahme erreichte.

Um die Sensitivität, Spezifität und Gesamtübereinstimmung der durch Prototypenprobenahme erzielten Testergebnisse im Vergleich zur Standardmethode zu bestimmen, führten wir einen paarweisen Vergleich der Probenahmemethoden an denselben Proben bei einer festen Hb-Spitzenkonzentration durch. Für den Pinnacle-Assay betrug die Sensitivität 95 %, die Spezifität 83 %, und insgesamt waren 38 von 43 Paaren konkordant (88 %) (Abb. S2). Nicht übereinstimmende Testpaare waren meist darauf zurückzuführen, dass die Prototypenproben positiv waren, während der Standard negativ war. Dies wurde typischerweise durch eine hohe Feststoffkonzentration (60 mg/ml in zwei Fällen) verursacht. Beim Accutest-Assay (Abb. S3) stimmten 19 von 20 Paaren überein (95 %). Insgesamt fanden wir eine Übereinstimmung von 90 % mit einer Sensitivität von 96 % und einer Spezifität von 86 % (Abb. 4D).

Mit dem Pinnacle-Assay haben wir auch Proof-of-Concept-Daten gesammelt, die darauf hindeuten, dass Störstoffe wie Toilettenpapier (das den Stuhl während der Sprüherosion bedeckt) und Urin (in verdünntem Urin gebadeter Stuhl, der 60 Sekunden lang eine Toilettenschüssel imitiert) keinen Einfluss auf die Testleistung haben zur Erosion). Wir haben für den n = 5-Test in jeder Bedingung sowohl für Toilettenpapier als auch für Urin eine 100-prozentige Übereinstimmung mit der Wahrheit gemessen (definiert als positives/negatives Ergebnis für dotierten/nicht dotierten Stuhl).

Das Ziel dieses Experiments bestand darin, die Machbarkeit der Mikrobiomanalyse an Proben zu demonstrieren, die aus unserem System entnommen wurden. Zur Standardverarbeitung wurden Stuhlproben entnommen und mit einem Spatel entnommen. Dann wurde derselbe Stuhl in die Toilettenschüssel gegeben, gespült und Proben wurden durch Sprüherosion gesammelt. Für die Studie wurden 4 Stühle verwendet, S1, S2, S3, S4. Als S4-Stuhl in die Toilettenschüssel gegeben wurde, wurden vor dem Spülen eine Minute lang auch 500 ml Urin hinzugefügt, um mögliche Kontaminationseffekte durch Urin zu untersuchen. Daher bezeichnen wir die Probe als S4u. S1 wurde in 6 biologischen Replikaten gemessen, S2, S3, S4u in dreifacher Ausführung für beide Probenahmeansätze. Sechs weitere S1-Replikate wurden zentrifugiert und der konzentrierte Schlamm für die Analyse verwendet. Insgesamt wurden n = 36 Proben einer 16S-rRNA-Mikrobiomanalyse unterzogen.

Es wurde festgestellt, dass die extrahierte DNA-Konzentration aus dem Stuhlprobenportal reichlich vorhanden ist (64 ng/μl im Vergleich zu 269 ng/μl bei einer herkömmlichen Probe) und für die ribosomale 16S-RNA-Gensequenzierung mehr als ausreichend ist. Alle 36 eingereichten Proben erfüllten die Mindestkriterien für die Analyse. Die Analyse der relativen Häufigkeit taxonomischer Bakteriengruppen nach Reihenfolge ergab, dass Clostridiales und Bacteroidales die am häufigsten vorkommenden Bakterien waren, wie bei gesunden Probanden zu erwarten war58 (Suppl. Abb. S4).

Wir haben die mikrobielle Diversität innerhalb der Probe (α-Diversität) für die Standardprobenahme und unsere Design-Probenahme sowie den Unterschied zwischen Proben, dh zwischen Probenahmeansätzen (β-Diversität), quantifiziert.

Die Artenvielfalt innerhalb der Stichprobe (α-Diversität, Shannon-Diversitätsindex) änderte sich über den Stichprobenansatz hinweg nicht signifikant (Abb. 5A). Alpha-Diversitätsanalysen wurden unter Verwendung eines linearen Mixed-Effects-Modells mit Stichprobenansatz als festem Effekt und Stuhl als zufälligem Effekt durchgeführt; Die p-Werte waren nicht signifikant, einschließlich für S4u, die mit Urin ausgespülte Probe.

Ergebnis der Mikrobiomanalyse von n = 36 Stuhlproben aus Stuhl S1, S2, S3 und s4u. (A) Mikrobielle Artenvielfalt innerhalb der Probe (Alpha-Diversität, Shannon-Index) nach Stuhl und nach Probenahmeansatz. * bezeichnet die vor der Nukleinsäureextraktion zentrifugierte Probe. (B) Hierarchische Clusterbildung unter Verwendung des Beta-Diversitätsindex, der die taxonomische Distanz zeigt: Die Clusterbildung erfolgt um die Stühle, nicht um den Stichprobenansatz. (C) P-Wert aus der Permanova-Analyse der Beta-Diversitätsmetrik zum Vergleich der Probenahmemethoden (Standard vs. Prototyp) für interessierende Testgruppen: alle Stuhlproben (Kontrolle für Stuhl), Stuhl 1 und Stuhl 4u. P < 0,05 ist statistisch unterschiedlich.

Die Beta-Diversität wurde für jedes Probenpaar für mehrere Metriken berechnet (nämlich Bray-Curtis, Jaccard, UniFrac und gewichtetes, nicht normalisiertes UniFrac). Hierarchisches Clustering wurde mithilfe von Beta-Diversity-Metriken durchgeführt. Eine Baumdiagrammdarstellung des Beta-Diversitätsindex von Bray Curtis in Abb. 5B zeigt die Datenclusterung um den Probenansatz und nicht um den Stichprobenansatz. Diese Daten verdeutlichen, dass die interindividuelle Variation des Mikrobioms, ein bekanntes Merkmal des Mikrobioms gesunder Personen59, ein wichtigerer Faktor ist als der Stichprobenansatz.

Eine permutationelle multivariate Varianzanalyse (Permanova) der Beta-Diversität wurde verwendet, um die beiden Stichprobenansätze zu vergleichen und die Nullhypothese zu testen.

Die Ergebnisse waren je nach Metrik und Stuhl unterschiedlich (Abb. 5C), wobei p-Werte unter p = 0,05 als signifikant angesehen wurden, was auf einen durch den Stichprobenansatz eingeführten Unterschied hinweist. Wir glauben, dass der bei der Sprüherosionsprobenahme verwendete Puffertyp Auswirkungen haben kann, da berichtet wurde, dass die Lagerung in verschiedenen Puffertypen die Profile des fäkalen Mikrobioms beeinflusst60. Interessanterweise führten alle vier Indizes für Stuhl S4u in der Permanova-Analyse zu p = 0,1 oder höher, was unsere Hypothese stützt, dass eine Urinkontamination ein begrenztes Problem darstellt. Bei unserem Design ist die Kontaktzeit zwischen Urin und Stuhl zeitlich begrenzt, im Gegensatz zu urinverunreinigenden Proben, die mit einem Stuhlsammelset gesammelt werden.

Das auf der Fest-Flüssig-Trennung basierende Stuhlprobenentnahmeverfahren eignet sich für ein breites Spektrum an Stuhlkonsistenzen. Eine Einschränkung besteht darin, dass es nicht für vollständig wässrigen Stuhlgang verwendet werden kann (dh BSFS 7); Allerdings führen verschiedene physiologische Zustände zu weichem oder wässrigem Stuhl, und das Auftreten eines solchen Stuhls ist selbst ein wichtiger GI-Biomarker. Konkret wird Durchfall klinisch als der Abgang von 3 weichen Stühlen innerhalb von 24 Stunden definiert. In der herkömmlichen Praxis beruht diese Diagnose im Allgemeinen auf der Selbstauskunft und weist daher eine begrenzte Genauigkeit auf, die sich auf die Behandlung auswirkt. Hier schlagen wir eine nicht-invasive Methode zur Überwachung von Durchfall vor, die auf einem analogen Sensor im Einklang mit der Toilettenabflussleitung beruht und mit der in Abb. 1 beschriebenen Konfiguration kompatibel ist.

Wir fanden heraus, dass die nephelometrische Trübung, eine auf Lichtstreuung basierende Messung der suspendierten Partikel in Lösung, ein empfindliches Maß für das Vorhandensein von gelöstem Stuhl in einer Wasserlösung ist. In statischen Chargentests (kein Durchfluss) haben wir Wasser, menschlichen Urin und Kot (sowohl geformt als auch flüssig) in Konzentrationen gemischt, die einer Toilettennutzung nachempfunden sind, wie in den Methoden beschrieben. In Wasser gebildeter Stuhl führte zu Trübungswerten im Bereich von 10 bis 120 FNU (Nephelometrische Formazin-Einheit), die sich deutlich von der Wasserbasislinie (T = 0,7 FNU) und von dem Wasser zugesetztem Urin (T = 1,1 ± 0,3 FNU, n = 5) unterschieden. Vollständig in Wasser aufgelöster Stuhl, der einem wässrigen BSFS 7-Stuhl nachempfunden ist, führte zu einer Sättigung des Trübungswerts > 1000 FNU (Abb. 6A).

(A) Messwerte des statischen Trübungsmessgeräts aus Lösungen, die Stühle unterschiedlicher Form enthalten, wie durch das BSFS definiert, gemessen nach t = 1 Minute Eintauchen. (B) Sensorausgabe, aufgezeichnet über Toilettenspülungen (bei t = 30 s) nur für Wasser und Urin und geformten Stuhl. (C) Sensorausgang, aufgezeichnet für gelöste Proben, die zu einem vorgegebenen Zeitpunkt gespült wurden, der dem Peak entspricht (Kurven sind zur Verdeutlichung sowohl über die vertikale als auch über die horizontale Achse verschoben). (D) Clusterdiagramm der Fläche unter der Kurve des Sensorausgangs nach Probentyp, Datenpunkte sind der Übersichtlichkeit halber beabstandet. Die gepunktete Linie stellt einen vorgeschlagenen Schwellenwert von 2 Vs dar, der gelöste Proben von anderen Abwassertypen trennt.

Wir haben einen wasserdichten analogen Trübungssensor (SEN0189) verwendet, der zur Überwachung der Wassertrübung in Haushaltsgeräten entwickelt wurde, um eine dynamische Messung der Trübung in Abwasserleitungen zu erhalten. Der Sensor wurde anhand des Trübungsmessgeräts Hach 2100Q (Beilage Abb. S5) kalibriert und erwies sich als linear bis zu einem Nassfeststoffgehalt von 30 mg/ml, mehr als ausreichend, um Durchfall im Toilettenabwasser zu erkennen. Es wurde festgestellt, dass der Einfluss von Toilettenpapier auf den Trübungssensor vernachlässigbar ist. Unter Verwendung einer Menge Toilettenpapier gemäß ASME-Standard 112.19.2 für keramische Sanitärarmaturen (unter „Methoden“) führten wir paarweise Messungen über verschiedene Konzentrationen von Stuhlersatz (Sojabohnenpaste) und/oder unter verschiedenen Bedingungen (gerührt oder abgesetzt) ​​durch. mit und ohne Toilettenpapierzusatz. Toilettenpapier führte nicht zu signifikant unterschiedlichen Messwerten (p = 0,7334 für n = 12 gepaarte Messungen mit und ohne Toilettenpapier). Dies war nicht überraschend, da die Zerfallszeit von Toilettenpapier zwischen 10 Minuten und Stunden liegt61 und durch starke Turbulenzen in a erleichtert wird Abwassersystem, weit hinter dem kleinen Rohr, das aus einer Toilette austritt62.

Wir haben die Trübungssonde im Tischaufbau der Hinterausgangstoilette installiert, um ihre dynamische Reaktion während der Toilettenspülung zu bewerten. Die Sonde wurde im Abwasserrohr installiert, das in das Wasser des S-Falles eingetaucht war, und der elektronische Adapter befand sich außerhalb des Rohrs (Beilage Abb. S6). Die Sensorsondenausgabe wurde mit dem folgenden Protokoll erfasst: 60-s-Aufzeichnung, Stuhl oder Urin wurde bei t = 10 s in die Schüssel gegossen, Toilettenspülung bei t = 30 s. Abbildung 6B zeigt typische Messwerte für Wasser und geformten Stuhl: Die durch eine Spülung erzeugten Turbulenzen können zum Zeitpunkt der Spülung zu einer kurzen Geräuschspitze führen, ansonsten bleibt die Ausgabe jedoch unverändert. Das Ausspülen einer trüben Lösung aus gelöstem Kot oder Ersatz führte zur Signatur eines einige Sekunden breiten Peaks bei t = 30 s (Abb. 6C). Gelegentlich führte das Eingießen der gelösten Probe in die Schüssel vor dem Spülen zu einem Trübungssensorsignal (obere Kurve in Abb. 6C), das anzeigte, dass die gelöste Probe die S-Falle passiert und den Sensor ohne Toilettenspülung erreicht hatte. Die für alle rund um die Spülung gemessenen Signale gemessene Fläche unter der Kurve ist in Abb. 6D dargestellt. Die Werte für Wasser, Urin und gebildeten Stuhl liegen entweder bei Null oder unter 2 Vs; Die für gelöste Proben gemessenen Werte liegen über 2 V, was darauf hindeutet, dass die AUC-Metrik als Schwelle zur Unterscheidung des Vorhandenseins von losem Stuhl verwendet werden kann.

Die Abneigung gegen den Umgang mit dem eigenen Stuhl ist wohl das größte Hindernis bei der Nutzung von Gesundheitsdaten aus dieser physiologischen Probe23,25,29. Diese Studie zeigte die Machbarkeit der Stuhlsammlung aus Toilettenabwässern und die Eignung der Probe für biochemische Analysen.

Zuvor veröffentlichte Arbeiten zur Toilettenstuhlanalyse verwendeten Sensoren oder Behälter in der Toilettenschüssel oder im Toilettensitz für die Stuhlbildgebung und erreichten nicht die diagnostische Spezifität biomolekularer Tests31,34. Wir berichten über eine Konfiguration, die eine Fest-/Flüssigkeitstrennung einer Stuhlprobe in einem bestimmten Bereich der Abwasserleitungen und Stuhlprobenahme durch Sprüherosion erreicht. Diese Konfiguration ist vorteilhaft, da sie mechanische Teile innerhalb der Abwasserleitung minimiert, die verschmutzen und versagen könnten, kein mechanisches Verschmieren der Probe hervorruft, was zu Kreuzkontaminationen führen könnte, und eine automatisierte Steuerung ermöglicht.

Dieser Ansatz zur Stuhlprobenahme erfolgt nach der Nutzung einer herkömmlichen Toilette außerhalb des Wirkungsbereichs des Benutzers und beseitigt erhebliche Hindernisse für die Stuhlprobenentnahme. Wir stellen uns ein zu Hause installiertes Stuhlprobenahmesystem zur Langzeitüberwachung der Darmgesundheit und -erkrankungen vor. Die Stuhlanalyse kann vor Ort durch POC-Geräte zur Messung eines für eine diagnostizierte chronische Erkrankung geeigneten Biomarkers oder durch Laboranalysen für Gesundheitsuntersuchungen und Forschungszwecke durchgeführt werden.

Wir haben die analytische Integrität der entnommenen Stuhlprobe mithilfe eines etablierten klinischen POC-Kits für okkultes Blut zum Screening auf GI-Krebs nachgewiesen. Wir glauben, dass der Ansatz auf weitere Stuhlbiomarker angewendet werden kann, bei denen eine häufige Überwachung die klinischen Ergebnisse verbessert. Beispielsweise könnte der Ansatz zur Messung von fäkalem Calprotectin verwendet werden, das bei Behandlungsentscheidungen für entzündliche Darmerkrankungen immer häufiger eingesetzt wird63. Stuhlbasierte POC-Tests können auch verwendet werden, um eine unbeabsichtigte Glutenexposition bei Patienten mit Zöliakie während einer glutenfreien Diät zu erkennen14.

Der Probenahmeansatz dieser Studie ergab Proben, die für die Mikrobiomanalyse geeignet waren. Obwohl die Anzahl der Proben begrenzt ist, deuten unsere Daten darauf hin, dass die 16S-rRNA-Mikrobiomanalyse problemlos mit sprüherosierten Proben durchgeführt werden kann und dass die Vermischung von Urin mit Stuhl im Abwasser offenbar keinen messbaren Effekt hervorruft. Weitere Studien sind erforderlich, um die Pufferauswahl zu optimieren und eine automatische Versiegelung verflüssigter Proben für den Versand an ein Labor zu implementieren.

Wir weisen darauf hin, dass die beiden in dieser Studie verwendeten Tests nicht von der genauen Menge des analysierten Kots abhängen, wie dies auch beim molekularanalytischen Screening auf fäkale Krankheitserreger der Fall ist. Zukünftige Arbeiten werden die Machbarkeit quantitativer Stuhltests, wie z. B. der Metabolitenanalyse, untersuchen, indem das feste Pellet analysiert wird, das durch Zentrifugieren einer sprüherodierten Stuhlprobe gewonnen wird.

Wir haben auch einen Echtzeit-Erkennungsansatz für losen Stuhl im Abwasser demonstriert. Das Auftreten von weichem/wässrigem Stuhl im Laufe der Zeit ist klinisch wichtig für die richtige Diagnose und Behandlung von Durchfall. Obwohl eine visuelle Beurteilung des Stuhlgangs nach dem Toilettengang problemlos durchgeführt werden kann, ist die Verfolgung des Stuhlgangs mühsam und anfällig für Ungenauigkeiten und kann die therapeutische Intervention verzögern oder anderweitig beeinträchtigen, insbesondere bei einer häufigen und chronischen Erkrankung wie dem Reizdarmsyndrom43.

Diese Studie war eine Machbarkeitsdemonstration und weist einige Einschränkungen auf. Das Testsystem war doppelt so groß wie eine Toilette und passte nicht in die Grundfläche eines Standardbadezimmers (mit einem Abstand von 12 Zoll zwischen dem Bodenablauf und der Wand gemäß Bauvorschriften). Die laufenden technischen Bemühungen konzentrieren sich darauf, das System kompakter zu machen, damit es ohne Änderungen an der Infrastruktur in einem Badezimmer installiert werden kann, und auf die Automatisierung des Betriebs von Durchflussventilen. Diese Studie beschränkte sich auch auf die Verwendung von gesundem menschlichem Stuhl, der außerhalb des Toilettensystems gesammelt wurde. Zukünftige Arbeiten werden den Ansatz anhand klinischer Proben und menschlicher Probanden, die das System verwenden, demonstrieren. Ein wichtiger Faktor bei der Toilettennutzung in der westlichen Welt, Toilettenpapier, wurde in dieser Studie nicht systematisch bewertet, obwohl vorläufige Daten darauf hindeuten, dass Toilettenpapier die Ergebnisse bei POC-Tests und Trübungsmessungen nicht beeinflusst.

Wenn wir uns die endgültige Implementierung dieser Technologie als Heimüberwachungssystem ansehen, gehen wir davon aus, dass die Kosten erschwinglich sein werden, da das System keine Spezialmaterialien oder Hochleistungsantriebe erfordert und im Wesentlichen auf Rohrformen und im Handel erhältlichen Ventilen zur Regulierung des Wasserflusses beruht aus der vorhandenen Spülkastenspülung. Wir stellen uns ein System vor, dessen Kosten im mittleren Bereich der aktuellen Toilettenpreise liegen und dessen Anschaffung letztendlich von der Krankenversicherung übernommen werden könnte.

Abschließend haben wir eine Konfiguration vorgestellt, die die Sammlung einzelner Stuhlproben aus Toilettenabwasser für biochemische Tests ermöglicht. Die hier präsentierten Daten unterstützen die Weiterentwicklung des Ansatzes zur Erreichung einer lückenlosen Erfassung von Stuhl-Biomarker-Daten für einen höheren Standard der Überwachung der Darmgesundheit und -erkrankungen.

Kot- und Urinproben wurden von gesunden, anonymen Freiwilligen gemäß einem vom Duke University Health System IRB 0010-5536 genehmigten Protokoll gesammelt. Alle Studienverfahren wurden in Übereinstimmung mit der Erklärung der einschlägigen Vorschriften und Verfahren der Helsinki- und Duke-Universität durchgeführt, und von allen Teilnehmern wurde eine Einverständniserklärung eingeholt.

Der Kot wurde in Toilettenhüten aus Plastik gesammelt und bei 4 °C gelagert. Vor jedem Test ließ man ihn 2 Stunden lang bei Raumtemperatur äquilibrieren. Der Urin wurde in sterilen 500-ml-Flaschen gesammelt und bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert. Als Ersatz für Fäkalien wurden Experimente mit Zylindern aus Sojabohnenpaste64 durchgeführt, sowohl in Latexhülle als auch ohne Hülle, wie in den Prüfnormen ASME 112.19.2 für keramische Sanitärarmaturen vorgeschrieben. Die bei Tests mit Surrogaten verwendete Menge beträgt 100, 150 und 200 g oder zwei Proben von 50 g. Sofern nicht anders angegeben, beträgt die in Experimenten verwendete Menge menschlicher Fäkalien entweder 50 oder 100 g (das mittlere Nassgewicht des Stuhls in Ländern mit hohem Einkommen beträgt 128 g53). Die Urinmenge, die ein normaler Erwachsener jedes Mal ausscheidet, liegt typischerweise zwischen 250 und 400 ml, wobei der mittlere Wert mit 233 (1400/6) ml angegeben wird53.

Das System wurde mit handelsüblichen Tiefspültoiletten zweier Typen getestet: einer Toilette mit hinterem Ausgang (Saniflo 093) und einer Toilette mit Ausgang unten (Kohler Wellworth K-4198), mit wassersparendem Spülkasten (4,8 l Spülung). Das Wasservolumen in der Toilettenschüssel wurde mit 1,85 ± 0,17 l für die Toilette mit Bodenausgang gemessen. Am 3-Zoll-Ausgang der Toiletten wurde ein hinterer P-Falle-Anschluss (Signature Hardware) mit Gummidichtung installiert, und für die Verbindung mit dem kundenspezifisch gestalteten Teil wurden 3-Zoll-PVC-Rohre, Winkelstücke und Anschlüsse verwendet. Das Stuhlimmobilisierungs- und Probenentnahmerohr wurde mit SolidWorks gezeichnet und in mehreren Versionen aus PLLA- und ABS-Material in 3D gedruckt. Es verfügt über eine sanfte Tauch- und Probenahmeöffnung am Boden, um Flüssigkeit durch Schwerkraft zu sammeln. Ventil 1 ist ein 3-Zoll-Absperrschieber, V2 ist ein 2-Zoll-Absperrschieber; Ventil 3 ist ein Kugelventil, das mit einem im 3D-gedruckten Teil enthaltenen Anschluss verbunden wird, um Totvolumen zu minimieren. Ventil 4 zur Probenentnahme war ein 3D-gedruckter Schwenkverschluss mit Gummistopfen, der so dimensioniert war, dass kein Totraum vorhanden war.

Zur Messung der bei der Standardprobenahme verwendeten Stuhlmasse wurde das Probenentnahmekit eines Tests auf okkultes Blut (Pinnacle Biolabs) verwendet. Die Stuhlmasse auf dem Rillenstab aus dem Kit wurde mit einer Analysenwaage gemessen. Die Waage wurde auch verwendet, um das Puffervolumen im Sammelkit (3 ml und 2,5 ml) zu messen. Der Nassfeststoffgehalt der mit dem Standardkit hergestellten Suspension wurde verhältnismäßig berechnet.

Die Sprüherosion wurde mit einer Pumpe (12 V PowerFlo) erreicht, die von einem Netzteil mit einstellbarer Spannung angetrieben wurde. Der Puffer wurde durch einen ¼-Zoll-Nylonschlauch und einen Adapter zu einer Präzisionsdüse (Lechlert 632.404) gepumpt. Die Durchflussrate wurde im Bereich von 0,4–1,1 Liter pro Minute gemessen und der Sprühdruck anhand der Tabelle des Düsenherstellers berechnet. Es wurden Stuhlproben von jeweils 35 g verwendet. Die verflüssigte Probe wurde durch Schwerkraft aus der unteren Probenahmeöffnung in einem sterilen 15-ml-Zentrifugenröhrchen gesammelt.

Um die Ergebnisse der Sprüherosion mit der Standardprobenahme zu vergleichen, wurde der Nassfeststoffgehalt der erodierten Suspension bestimmt. Zunächst wurde der Trockenmassegehalt nach der konventionellen Gesamtfeststoffmethode (Ofen bei 105 °C für mindestens 4 Stunden) gemessen. Angesichts der Definition des Feuchtigkeitsgehalts MC (%) = (Nassgewicht − Trockengewicht)/Nassgewicht; Das Nassfeststoffgewicht wurde unter Verwendung eines nominalen MC-Werts von 75 % für Fäkalien berechnet. Der Feuchtigkeitsgehalt von Fäkalien liegt zwischen 50 und 80 % mit einem Durchschnittswert von 75 % über mehrere Studien hinweg53. Alle in dieser Arbeit angegebenen Feststoffgehaltsergebnisse beziehen sich auf das Nassfeststoffgewicht.

Die Bakterien wurden mithilfe der Methode der wahrscheinlichsten Zahl (MPN) gezählt, wie zuvor beschrieben65. Die Proben wurden in sterilen Zentrifugenröhrchen gesammelt und bis zum Ausplattieren bei 4 °C gelagert. Reihenverdünnungen (10–1–10–8) jeder Probe wurden dreifach in Lysogenie-Brühe in sterilen Zellkulturplatten mit 48 Vertiefungen hergestellt. Die Proben wurden vor der Analyse 48 Stunden lang bei 37 °C inkubiert.

Es wurden zwei Assays zum Nachweis von menschlichem Hämoglobin (Hb) verwendet: 1. der FIT der zweiten Generation von Pinnacle Biolabs mit einem nominalen Grenzwert von 50 ng/ml Hb im Puffer (entspricht 6 μg Hb/g Kot); und 2. Accutest® iFOBT von Jant Pharmacal Corporation mit einem nominalen Grenzwert von 50 ng/ml Hb im Puffer oder 50 μg Hb/g Kot.

Die Kits wurden gemäß den Herstelleranweisungen verwendet. Der gerillte Stab wurde sechsmal in die Stuhlprobe gestochen, dann wurde der gerillte Stab auf das Pufferröhrchen (3 ml Pinnacle, 2,5 ml Accutest) geschraubt und manuell geschüttelt. Eine Spitzenabdeckung des Röhrchens wurde entfernt, um (3 Tropfen, gemessen als 75 μl bei Pinnacle, oder 4 Tropfen, gemessen als 100 μl, Accutest) der Suspension auf die Kartusche zu verteilen.

Zum Dotieren wurde menschliches Hämoglobin (H7379-1G, Sigma Aldrich) verwendet. Es wurde ein spezielles Verfahren entwickelt, um ganze Stühle zu spicken und gleichzeitig ihre Form beizubehalten. Der Prozess besteht aus dem 50-fachen manuellen Falten des gesamten Stuhls, gemischt mit Dotierungslösung (100–500 μl Lösung für 100 g Feststoff), unter Verwendung eines Spatels, wie im Zusatzvideo S3 gezeigt.

Damit dieser Test reproduzierbar war, wurden feste Mengen an Stuhl und Urin in einem Behälter auf dem Labortisch gemischt und dann manuell in den Prototyp zur Sprüherosion gegeben. Als Obergrenze des Urinvolumens wurde 500 ml verwendet. Aus praktischen Gründen wurden die Mengen um den Faktor 5 verkleinert. Wir kombinierten 200 g/5 = 40 g Kot, 500 ml/5 = 100 ml Urin und 1,85/5 = 0,4 l Wasser (entsprechend dem Schüsselvolumen). Nach 1 Minute wurde der Kot mit einem Schaumlöffel gesammelt und zur Sprüherosion bei 10 psi für etwa 5 Sekunden in den Prototyp gegeben.

Damit dieser Test reproduzierbar ist, haben wir feste Mengen Stuhl und Toilettenpapier in einem Behälter kombiniert und zur Sprüherosion in den Prototyp gegeben. Wir haben die Probe mit einem gerillten Stab für den Test auf okkultes Blut nach der Standardmethode entnommen, bevor wir das Toilettenpapier hinzugefügt haben. Wir haben 40 g Stuhl und 6 Blatt Toilettenpapier verwendet und mit 400 ml Wasser vermischt, um das Toilettenpapier vollständig feucht zu machen. Mit einem Schaumlöffel sammelten wir den Stuhl und das Toilettenpapier ein und legten sie in den Prototyp. Dabei stellten wir sicher, dass das Toilettenpapier den Stuhl bedeckte. Wir führten etwa 5 Sekunden lang eine Sprüherosion bei 10 psi durch und sammelten die erodierte Flüssigkeit ohne Änderung des Verfahrens.

Stuhlproben wurden gemäß den Anweisungen der Microbiome Shared Resource (MSR) von Duke Genomics and Computational Biology (GCB) entnommen. Ein Metallspatel erreichte den Kern des Stuhls und extrahierte etwa 250 mg Probe. Sechs solcher Entnahmen wurden aus separaten Bereichen des Stuhls durchgeführt, die jeweils bis in den Kern des Stuhls reichten. Die extrahierten Proben wurden in ein 1,2-ml-Kryoröhrchen gegeben.

Dann wurde derselbe Stuhl in die Toilettenschüssel gegeben und gespült, und nacheinander durch Sprühen erodierte Proben wurden in einem sterilen 15-ml-Zentrifugenröhrchen gesammelt. Ein Teil der gesammelten Flüssigkeitsproben wurde in ein 1,2-ml-Kryoröhrchen überführt. Für Probe S1 wurden sechs Replikate 10 Minuten lang bei 5000 U/min zentrifugiert und der Überstand verworfen, um einen konzentrierteren Schlamm für die Analyse bereitzustellen.

Nach der Lagerung über Nacht bei –20 °C wurden die Proben auf Eis in GCBMSR überführt, wo sie bis zur Verarbeitung gemäß Standardprotokollen bei –80 °C gelagert wurden.

Die gesamte mikrobielle DNA wurde mithilfe von Protokollen extrahiert, die von der Human Microbiome Roadmap Initiative standardisiert wurden. Die DNA wurde mit dem Qiagen PowerSoil ProDNA Isolation Kit isoliert. Die extrahierte DNA-Konzentration wurde mit dem Nanodrop8000-Spektrometer gemessen und ergab 64 ng/μL für die verarbeitete Probe und 269 ng/μL für die herkömmliche Probe.

Die Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft in isolierten DNA-Proben wurde durch Amplifikation der variablen V4-Region des 16S-rRNA-Gens durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung des Vorwärtsprimers 515 und des Rückwärtsprimers 806 der 16S-rRNA gemäß dem Earth Microbiome Project-Protokoll charakterisiert. Die Primer (515F und 806R) tragen einzigartige Barcodes, die das Multiplexen und Co-Sequenzieren von Hunderten von Proben gleichzeitig ermöglichen. Äquimolare 16S-rRNA-PCR-Produkte wurden mit Promega GloMax quantifiziert und für die Sequenzierung gepoolt. Die Sequenzierung wurde auf einem Illumina MiSeq-Sequenziergerät mit 250 Basenpaar-Paired-End-Sequenzierungsläufen (mit bis zu 384 Proben pro Spur-Sequenzierungsläufen) durchgeführt. Rohe Lesevorgänge wurden über Qiime 2.0 in ASV-Zähltabellen (Amplicon Sequence Variant) verarbeitet. Die Daten wurden einer Qualitätskontrolle durch Rauschunterdrückung und Dereplikation der Lesevorgänge sowie durch zusätzliche Filterung unterzogen. Die Taxonomie wurde ASVs unter Verwendung des q2-Feature-Classifier-Classify-Sklearn-naiven Bayes-Taxonomie-Klassifikators anhand der SILVA 132-Datenbank zugewiesen. Die negative Extraktionskontrolle wurde verwendet, um potenziell kontaminierende ASVs mithilfe der Prävalenz- und Post-PCR-DNA-Quantifizierungsschwellenwerte über das Decontam-Paket in R herauszufiltern.

Für statische Trübungsmessungen wurde ein kalibriertes Trübungsmessgerät Hach 2100Q (Hach, Colorado, USA) verwendet. Eine einmalige Toilettennutzung wurde unter Verwendung physiologischer Ausscheidungswerte von 130 g Stuhlmasse und 400 ml Urin in 4,8 l Zisternenspülvolumen emuliert, was zu 0,03 g/ml Kot und 0,08 ml/ml Urin in Wasser (Vol./Vol.) führte. Wir haben die Verwendung von Toilettenpapier gemäß den im ASME-Standard 112.19.2 geforderten Werten von 4 Kugeln aus 6 einlagigen Blättern dargestellt.

Für dynamische Messungen wurden gelöste Proben aus geformten Proben durch 1:1-Gewichtsverdünnung in Wasser und Mischen erhalten, um eine homogene Suspension für wiederholte 100-ml-Testmessungen zu erhalten.

Eine analoge Trübungssonde mit Kabeln und Platine (SEN0189 von DF Robot) wurde mit einer Arduino Uno-Platine (DFRduino UNO v3, DF Robot) verbunden. Arduino wurde zur Entwicklung des Sensorcodes verwendet und Teraterm-Software zur Konvertierung der Aufzeichnung in eine .CSV-Datei wurde verwendet, um die Daten des Trübungssensors mit einer zeitlichen Auflösung von 0,25 s zu protokollieren.

Alle Daten mit Ausnahme der Mikrobiomdaten wurden in Microsoft Excel 2016 aufgezeichnet. Trübungsdaten wurden mit GraphPad Prism 9.1.2 analysiert. Die Normalität der Unterschiede zwischen gepaarten Trübungsmessungen wurde mit dem Anderson-Darling-Test überprüft, wobei ein ap-Wert von < 0,05 als statistisch signifikant angesehen wurde. Da die Unterschiede in den Messungen den Normalitätstest nicht bestanden (p = 0,0006), wurde ein nichtparametrischer Test (Wilcoxon-Matched-Pairs-Signed-Rank-Test) verwendet, um zu bestimmen, ob die Unterschiede zwischen gepaarten Messungen signifikant waren (p < 0,05).

Alle mit dieser Studie verbundenen Daten sind in der Arbeit oder den ergänzenden Materialien enthalten. Alle Informationen und Materialien können beim entsprechenden Autor angefordert werden.

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Diese Forschung wurde teilweise durch das Duke Bass Connection Program, durch Duke MEDx und durch philanthropische Spenden an das Duke Center for WaSH-AID finanziert. Die Geldgeber hatten keinen Einfluss auf das Studiendesign, die Datenerhebung und -analyse, die Entscheidung zur Veröffentlichung oder die Erstellung des Manuskripts. Wir danken Frau Mara Shurgot für die Bearbeitung des Manuskripts und der Videos. Wir danken Herrn Ben Snyder für seine Hilfe bei der Aufnahme des Videos über den Betrieb des Systems.

Elektrotechnik und Informationstechnik, Zentrum für Wasser, Sanitärversorgung, Hygiene und Infektionskrankheiten (WaSH-AID), Duke University, Durham, NC, USA

Sonia Grego, Claire M. Welling, Graham H. Miller, Peter F. Coggan, Katelyn L. Sellgren, Brian T. Hawkins und Brian R. Stoner

Duke Center for Applied Genomics and Precision Medicine, School of Medicine, Duke University, Durham, NC, USA

Geoffrey S. Ginsburg

Abteilung für Gastroenterologie, School of Medicine, Duke University, Durham, NC, USA

Jose R. Ruiz und Deborah A. Fisher

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SG, BTH und BRS konzipierten und planten die Studie. CMW und KLS bereiteten die Stuhlproben vor und führten Tests durch, GSG leitete die Mikrobiomstudie. GHM und BRS entwarfen und montierten das technische System und sammelten Betriebsdaten. PFC hat den Code geschrieben und die Datenerfassung für die Trübungssensorexperimente durchgeführt. SG, JRR und DAF waren an der Dateninterpretation beteiligt. SG, BTH, DAF und GSG haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben dieses Papier gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Sonia Grego.

SG, KLS, BTH und BRS sind Erfinder einer Patentanmeldung im Zusammenhang mit einer Toilette zur Entnahme von Exkrementen (PCT/US 21/18765). SG, GSG und BRS sind Mitbegründer von Coprata Inc., einem Unternehmen, das Toilettentechnologie für die Entnahme von Exkrementen entwickelt. JRR ist Berater für Coprata. DAF ist jetzt bei Eli Lilly and Company beschäftigt. DAF war außerdem als Berater für Exact Sciences und Guardant Health tätig, beide Unternehmen entwickelten Darmkrebs-Früherkennungstests. Andere Autoren haben kein konkurrierendes Interesse.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Grego, S., Welling, CM, Miller, GH et al. Ein freihändiges Stuhlprobensystem zur Überwachung der Darmgesundheit und -krankheit. Sci Rep 12, 10859 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-14803-9

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Eingegangen: 06. März 2022

Angenommen: 13. Juni 2022

Veröffentlicht: 27. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-14803-9

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