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Dec 07, 2023

Biomimetisches kardiales Gewebekulturmodell (CTCM) zur Nachbildung der kardialen Physiologie und Pathophysiologie ex vivo

Band Kommunikationsbiologie

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 934 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Es besteht Bedarf an einem zuverlässigen In-vitro-System, das die kardiale physiologische Umgebung für Arzneimitteltests genau nachbilden kann. Die begrenzte Verfügbarkeit menschlicher Gewebekultursysteme für das Herz hat zu ungenauen Interpretationen kardiologischer Arzneimittelwirkungen geführt. Hier haben wir ein Herzgewebekulturmodell (CTCM) entwickelt, das Herzschnitte mit physiologischen Dehnungen in Systole und Diastole während des Herzzyklus elektromechanisch stimulieren kann. Nach 12 Tagen in Kultur verbesserte dieser Ansatz teilweise die Lebensfähigkeit der Herzschnitte, behielt jedoch ihre strukturelle Integrität nicht vollständig bei. Daher stellten wir nach dem Screening kleiner Moleküle fest, dass der Einbau von 100 nM Triiodthyronin (T3) und 1 μM Dexamethason (Dex) in unsere Kulturmedien die mikroskopische Struktur der Scheiben 12 Tage lang bewahrte. In Kombination mit der T3/Dex-Behandlung hielt das CTCM-System das Transkriptionsprofil, die Lebensfähigkeit, die Stoffwechselaktivität und die strukturelle Integrität 12 Tage lang auf dem gleichen Niveau wie das frische Herzgewebe. Darüber hinaus führte eine Überdehnung des Herzgewebes in Kultur zu einer Herzhypertrophie-Signalisierung, was einen Machbarkeitsnachweis für die Fähigkeit des CTCM darstellt, durch Herzdehnung induzierte hypertrophe Zustände zu emulieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CTCM die kardiale Physiologie und Pathophysiologie in Kultur über einen längeren Zeitraum nachahmen kann und so ein zuverlässiges Arzneimittelscreening ermöglicht.

Vor klinischen Studien besteht ein Bedarf an zuverlässigen In-vitro-Systemen, die die physiologische Umgebung des menschlichen Herzens genau nachbilden können. Solche Systeme sollten veränderte mechanische Dehnungen, Herzfrequenz und elektrophysiologische Eigenschaften modellieren. Tiermodelle, die am häufigsten verwendete Screening-Plattform für die Herzphysiologie, weisen eine begrenzte Zuverlässigkeit bei der Nachbildung der im menschlichen Herzen beobachteten Wirkungen von Medikamenten auf1,2. Letztendlich ist das ideale experimentelle Herzgewebekulturmodell (CTCM) dasjenige, das eine hohe Sensitivität und Spezifität für verschiedene therapeutische und pharmakologische Interventionen aufweist und gleichzeitig die Physiologie und Pathophysiologie des menschlichen Herzens genau nachbildet3. Das Fehlen eines solchen Systems hat die Arzneimittelentwicklung für neue Therapeutika gegen Herzinsuffizienz eingeschränkt4,5 und dazu geführt, dass die medikamenteninduzierte Kardiotoxizität eine der Hauptursachen für den Marktrückzug ist6.

Im letzten Jahrzehnt wurden acht nicht kardiovaskuläre Medikamente aus der klinischen Anwendung genommen, weil sie eine Verlängerung des QT-Intervalls induzieren, was zu ventrikulären Arrhythmien und plötzlichem Tod führt7. Daher besteht ein wachsender Bedarf an zuverlässigen präklinischen Screening-Strategien zur Beurteilung der kardiovaskulären Wirksamkeit und Toxizität. Die jüngste Verlagerung hin zur Verwendung von vom Menschen induzierten pluripotenten Kardiomyozyten aus Stammzellen (hiPS-CMs) beim Arzneimittelscreening und bei Toxizitätstests hat eine Teillösung für dieses Problem geliefert; Allerdings sind die unausgereifte Natur der hiPS-CMs und das Fehlen der vielzelligen Komplexität des Herzgewebes wesentliche Einschränkungen dieser Technologie8. Jüngste Bemühungen haben gezeigt, dass diese Einschränkung teilweise überwunden werden kann, wenn hiPS-CMs im Frühstadium kurz nach Beginn spontaner Kontraktionen zur Bildung von Hydrogelen im Herzgewebe verwendet und im Laufe der Zeit einer allmählichen Zunahme der elektrischen Stimulation ausgesetzt werden9. Diesen hiPS-CMs-Mikrogeweben fehlen jedoch die ausgereiften elektrophysiologischen und kontraktilen Eigenschaften des erwachsenen menschlichen Myokards. Darüber hinaus ist das menschliche Herzgewebe strukturell komplizierter und besteht aus einer heterogenen Mischung verschiedener Zelltypen, darunter Endothelzellen, Neuronen und Stromafibroblasten, die mit einer bestimmten Anordnung extrazellulärer Matrixproteine ​​verbunden sind10. Diese Heterogenität der Nicht-Kardiomyozyten-Zellpopulation11,12,13 im Herzen erwachsener Säugetiere ist ein großes Hindernis bei der Modellierung von Herzgewebe unter Verwendung einzelner Zelltypen. Diese großen Einschränkungen unterstreichen die Bedeutung der Entwicklung von Methoden zur Kultivierung von intaktem Myokardgewebe unter physiologischen und pathologischen Bedingungen9.

Kultivierte dünne (300 μm) menschliche Herzschnitte erweisen sich als vielversprechendes Modell des intakten menschlichen Myokards. Diese Technologie ermöglicht den Zugang zu einem vollständigen dreidimensionalen Vielzellsystem ähnlich dem menschlichen Herzgewebe. Allerdings war die Verwendung von Herzschnitten vor 2019 durch die kurze Lebensfähigkeitsdauer in der Kultur (24 Stunden) begrenzt14,15,16. Dies ist auf mehrere Faktoren zurückzuführen, darunter das Fehlen einer physiologischen mechanischen Dehnung, die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche und die Verwendung eines einfachen Kulturmediums, das den Anforderungen des Herzgewebes nicht gerecht wird. Im Jahr 2019 zeigten mehrere Gruppen, dass die Einbeziehung mechanischer Faktoren in Herzgewebekultursysteme die Kulturlebensdauer verlängern, die Herzexpression verbessern und Herzpathologie modellieren könnte. Zwei elegante Studien17 und 18 haben den positiven Einfluss einer einachsigen mechanischen Belastung auf den Herzphänotyp während der Kultur gezeigt. Allerdings nutzten diese Studien nicht die dynamische dreidimensionale physiologische mechanische Belastung des Herzzyklus, da die Herzscheiben entweder mit isometrischen Dehnungskräften17 oder linearer auxotonischer Belastung18 belastet wurden. Diese Methoden der Gewebedehnung führten zur Herunterregulierung mehrerer Herzgene oder zur Überexpression von Genen, die mit der pathologischen Dehnungsreaktion zusammenhängen. Insbesondere haben Pitoulis et al.19 ein dynamisches Herzschnittkulturbad entwickelt, um den Herzzyklus mithilfe von Kraftwandler-Feedback und einem Streckbetätiger nachzubilden. Während dieses System eine genauere Simulation des Herzzyklus in vitro ermöglichte, schränken die Komplexität der Methode und der geringe Durchsatz die Anwendung des Systems ein. Unser Labor hat kürzlich ein vereinfachtes Kultursystem entwickelt, das elektrische Stimulation und ein optimiertes Kulturmedium verwendet, um Herzgewebeschnitte von Schweinen und Menschen bis zu 6 Tage lang lebensfähig zu halten20,21.

Im aktuellen Manuskript beschreiben wir anhand von Schweineherzschnitten ein kardiales Gewebekulturmodell (CTCM), das die dreidimensionalen kardialen physiologischen und pathophysiologischen Strecken während des Herzzyklus in Kombination mit humoralen Hinweisen rekapituliert. Dieses CTCM hat das Potenzial, die Genauigkeit der präklinischen Medikamentenvorhersage auf ein bisher unerreichtes Niveau zu bringen, indem es ein kostengünstiges Herzsystem mit mittlerem Durchsatz bereitstellt, das die physiologischen/pathophysiologischen Herzdehnungen von Säugetieren für präklinische Medikamententests nachahmt.

Hämodynamische mechanische Signale spielen eine entscheidende Rolle bei der Erhaltung der Funktionalität von Kardiomyozyten in vitro22,23,24. Im aktuellen Manuskript haben wir ein CTCM entwickelt (Abb. 1a), das das Herzmilieu eines Erwachsenen nachahmen kann, indem es gleichzeitig elektrische und mechanische Stimulation mit der physiologischen Frequenz (1,2 Hz, 72 Schläge pro Minute) induziert. Um eine Überdehnung des Gewebes während der diastolischen Phase zu vermeiden, wurden die Gewebe mithilfe eines dreidimensional gedruckten Geräts um 25 % überdimensioniert (Abb. 1b). Die durch ein C-PACE-System induzierte elektrische Stimulation wurde mithilfe eines Datenerfassungssystems so synchronisiert, dass sie 100 ms vor der systolischen Phase begann, um den Herzzyklus vollständig zu reproduzieren. Das Gewebekultursystem verwendet einen programmierbaren pneumatischen Antrieb (LB Engineering, Deutschland), um eine flexible Silikonmembran zyklisch auszudehnen und so die Dehnung der Herzscheiben in den darüber liegenden Kammern zu bewirken. Das System ist über eine Drucksonde an eine externe Luftleitung angeschlossen, die eine Feineinstellung des Drucks (± 1 mmHg) und des Timings (± 1 ms) ermöglicht (Abb. 1c).

a Die Gewebescheiben werden in der Kulturkammer des Geräts an blau dargestellten Stützringen mit 7 mm Durchmesser befestigt. Die Kulturkammer war durch eine dünne, flexible Silikonmembran von der Luftkammer getrennt. Zwischen jeder Kammer wurde eine Dichtung angebracht, um Undichtigkeiten zu verhindern. Die Abdeckung des Geräts enthält Graphitelektroden, die für eine elektrische Stimulation sorgen. b Schematische Darstellung der Vorrichtung zur Gewebeüberdimensionierung, der Ringführung und des Stützrings. Gewebescheiben (braun) werden auf dem Überdimensionierungsgerät positioniert und die Ringführung in die Nut am äußeren Rand des Geräts gelegt. Mithilfe der Schablone wird der mit Histoacrylkleber beschichtete Stützring vorsichtig auf die Herzgewebescheibe aufgesetzt. c Ein Diagramm, das den Zeitpunkt der elektrischen Stimulation im Verhältnis zum Druck in der Luftkammer darstellt, gesteuert durch den programmierbaren pneumatischen Treiber (PPD). Ein Datenerfassungsgerät wurde verwendet, um die elektrische Stimulation mithilfe eines Drucksondensensors zu synchronisieren. Wenn der Druck in der Kulturkammer einen bestimmten Schwellenwert erreicht, wird ein Impulssignal an das C-PACE-EM-Gerät gesendet, um eine elektrische Stimulation auszulösen. d Bild von vier CTCM-Geräten, die auf einem Regal eines Inkubators aufgestellt sind. Diese vier Geräte werden von Fluggesellschaften an ein einziges PPD angeschlossen und ein Drucksensor wird in ein hämostatisches Ventil eingesetzt, um den Druck innerhalb der Fluggesellschaft zu überwachen. Jedes Gerät kann sechs Gewebeschnitte aufnehmen.

Mit einem pneumatischen Treiber können wir 4 CTCM-Geräte bedienen, die jeweils 6 Gewebeschnitte aufnehmen können (Abb. 1d). Innerhalb des CTCM werden die Luftdrücke in den Luftkammern in synchronisierte Drücke in der Flüssigkeitskammer umgewandelt und bewirken eine physiologische Dehnung der Herzscheiben (Abb. 2a und Zusatzfilm 1). Die Beurteilung der Gewebedehnung bei 80 mmHg ergab eine Dehnung des Gewebeschnitts um 25 % (Abb. 2b). Es wurde gezeigt, dass diese prozentuale Dehnung einer physiologischen Sarkomerlänge von 2,2–2,3 μm für eine normale Kontraktilität von Herzscheiben entspricht17,19,25. Gewebebewegungen werden mithilfe eines benutzerdefinierten Kameraaufbaus beurteilt (ergänzende Abbildung 1). Die Amplitude der Gewebebewegung und die Geschwindigkeitsrate (Abb. 2c, d) stimmen mit der Dehnung während des Herzzyklus und dem Timing während Systole und Diastole überein (Abb. 2b). Die Dehnung und Geschwindigkeit des Herzgewebes während der Kontraktion und Entspannung blieb über die 12 Tage in der Kultur konstant (Abb. 2e). Um die Auswirkung der elektrischen Stimulation auf die Kontraktilität während der Kultur zu beurteilen, haben wir eine Methode zur Bestimmung der Lebendbelastung mithilfe des Shape from Shading-Algorithmus entwickelt (ergänzende Abbildung 2a, b) und konnten zwischen der Belastung mit und ohne elektrische Stimulation unterscheiden gleiche Herzscheiben (Abb. 2f). Die Belastung mit elektrischer Stimulation ist innerhalb der Bewegungsbereiche der Schichten (R6-9) um 20 % höher als ohne elektrische Stimulation, was auf den Beitrag der elektrischen Stimulation zur kontraktilen Funktion hinweist.

a Repräsentative Spuren des Luftkammerdrucks, des Flüssigkeitskammerdrucks und der Gewebebewegungsmessungen bestätigten, dass der Luftkammerdruck den Flüssigkeitskammerdruck ändert, was eine entsprechende Gewebeschnittbewegung induziert. b Repräsentative Spuren der prozentualen Dehnung (blau) der Gewebescheiben entsprechen der prozentualen Dehnungsrate (orange). c Die gemessene Herzscheibenbewegung stimmte mit der gemessenen Bewegungsgeschwindigkeit überein. (d) Repräsentative Spur der Bewegungen des Herzscheibenzyklus (blaue Linie) und der Geschwindigkeit (gepunktete orange Linie). e Quantifizierung der Zykluszeit (n = 19 Scheiben/Gruppe von verschiedenen Schweinen), Kontraktionszeit (n = 19 Scheiben/Gruppe), Relaxationszeit (n = 19 Scheiben/Gruppe von verschiedenen Schweinen), Gewebebewegung (n = 25 Scheiben). /Gruppe von verschiedenen Schweinen), Spitzenkontraktionsgeschwindigkeit (n = 24 (D0), 25 (D12) Scheiben/Gruppe von verschiedenen Schweinen); und Spitzenrelaxationsgeschwindigkeiten (n = 24(D0), 25 (D12) Scheiben/Gruppe von verschiedenen Schweinen). Zweiseitige Student-T-Tests ergaben keinen signifikanten Unterschied bei keinem der Parameter. f Repräsentative Kurve für die Dehnungsanalyse eines Gewebeschnitts mit (rot) und ohne (blau) elektrischer Stimulation über zehn regionale Bereiche des Gewebeschnitts aus demselben Schnitt. Das untere Feld zeigt die Quantifizierung des prozentualen Unterschieds in der Belastung von Gewebeschnitten mit und ohne elektrische Stimulation über zehn regionale Bereiche aus verschiedenen Schnitten. (n = 8 Scheiben/Gruppe von verschiedenen Schweinen, es wird ein zweiseitiger Student-t-Test durchgeführt; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). Fehlerbalken sind repräsentativ für den Mittelwert ± SD.

In unserem vorherigen statischen biomimetischen Herzschnittkultursystem20,21 haben wir die Lebensfähigkeit, Funktionalität und strukturelle Integrität von Herzschnitten sechs Tage lang durch die Anwendung elektrischer Stimulation und eine optimierte Zusammensetzung des Kulturmediums aufrechterhalten. Nach 10 Tagen kam es jedoch zu einem starken Rückgang dieser Parameter. Wir beziehen uns auf Schnitte, die in unserem vorherigen statischen biomimetischen Kultursystem20,21 kultiviert wurden, als Kontrollbedingung (Strg), und wir beziehen uns auf die Schnitte, die unter synchronisierter mechanischer und elektrischer Stimulation (CTCM) unter Verwendung unserer zuvor optimierten Kulturmedien kultiviert wurden, als MC-Bedingung. Zunächst stellten wir fest, dass die mechanische Stimulation ohne elektrische Stimulation nicht ausreicht, um die Lebensfähigkeit des Gewebes für 6 Tage aufrechtzuerhalten (ergänzende Abbildung 3a, b). Interessanterweise wurde durch die Einführung sowohl physiologischer mechanischer als auch elektrischer Stimulationen mithilfe des CTCM die Lebensfähigkeit von 12-Tage-Herzschnitten ähnlich wie bei frischen Herzschnitten im MC-Zustand aufrechterhalten, jedoch nicht im Ctrl-Zustand, wie der MTT-Assay zeigt (Abb. 3a). Dies weist darauf hin, dass die mechanische Stimulation und Simulation des Herzzyklus die Lebensfähigkeit von Gewebeschnitten doppelt so lange aufrechterhalten kann wie in unserem vorherigen statischen Kultursystem. Die Beurteilung der strukturellen Integrität der Gewebeschnitte durch Immunmarkierung für kardiales Troponin-T und Connexin 43 zeigte jedoch, dass die Connexin 43-Expression des MC-Gewebes vom 12. Tag signifikant höher war als die Kontrolle am selben Tag. Dennoch blieb die einheitliche Expression von Connexin43 und die Z-Disc-Bildung nicht vollständig erhalten (Abb. 3b). Wir verwendeten ein auf künstlicher Intelligenz (KI) basierendes Framework zur Quantifizierung der strukturellen Integrität des Gewebes26, basierend auf einer bildbasierten Deep-Learning-Pipeline für die automatisierte Quantifizierung der strukturellen Integrität der Herzschnitte basierend auf Troponin-T- und Connexin-43-Färbung im Hinblick auf die Lokalisierung und Fluoreszenzintensität. Diese Technik nutzt ein Convolutional Neural Network (CNN) und das Deep-Learning-Framework, um die strukturelle Integrität des Herzgewebes auf automatisierte und unvoreingenommene Weise zuverlässig zu quantifizieren, wie in Lit. beschrieben. 26. MC-Gewebe zeigte am Tag 0 im Vergleich zu den statischen Kontrollschnitten eine verbesserte strukturelle Ähnlichkeit. Darüber hinaus zeigte Massons Trichrom-Färbung am 12. Tag der Kultur einen deutlich geringeren prozentualen Anteil der Fibrosefläche im MC-Zustand im Vergleich zum Kontrollzustand (Abb. 3c). Während die CTCM die Lebensfähigkeit von Herzgewebeschnitten vom 12. Tag auf ein ähnliches Niveau wie frisches Herzgewebe verbesserte, verbesserte sie die strukturelle Integrität der Herzschnitte nicht wesentlich.

Ein Balkendiagramm zeigt die Quantifizierung der MTT-Lebensfähigkeit von frischen Herzschnitten (D0) oder Herzschnittkulturen für 12 Tage, entweder in statischer Kultur (D12 Ctrl) oder in CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl). ), 12 (D12 MC) Scheiben/Gruppe von verschiedenen Schweinen, ein einfacher ANOVA-Test wird durchgeführt; ####p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und **p < 0,01 im Vergleich zu D12 Ctrl). b Repräsentative Immunfluoreszenzbilder für Troponin-T (grün), Connexin 43 (rot) und DAPI (blau) für frisch isolierte Herzschnitte (D0) oder Herzschnitte, die 12 Tage lang unter statischen Bedingungen (Strg) oder CTCM-Bedingungen (MC) kultiviert wurden. (Maßstab blank = 100 µm). Quantifizierung der strukturellen Integrität des Herzgewebes durch künstliche Intelligenz (n = 7 (D0), 7 (D12 Strg), 5 (D12 MC) Schnitte/Gruppe jeweils von verschiedenen Schweinen, einseitiger ANOVA-Test wird durchgeführt; ####p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und ****p < 0,0001 im Vergleich zu D12 Strg). c Repräsentative Bilder (links) und Quantifizierung (rechts) für Herzschnitte, die mit Massons Trichrom-Färbung gefärbt wurden (Maßstab blank = 500 µm) (n = 10 Schnitte/Gruppe jeweils von verschiedenen Schweinen, einseitiger ANOVA-Test wird durchgeführt; #### p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und ***p < 0,001 im Vergleich zu D12 Strg). Fehlerbalken sind repräsentativ für den Mittelwert ± SD.

Wir stellten die Hypothese auf, dass durch den Einbau kleiner Moleküle in das Kulturmedium die Integrität der Kardiomyozyten verbessert und die Entwicklung von Fibrose während der CTCM-Kultur verringert werden könnte. Daher führten wir ein Screening auf kleine Moleküle mit unserer statischen Kontrollkultur20,21 durch, da damit weniger Störfaktoren verbunden sind. Für dieses Screening wurden Dexamethason (Dex), Trijodthyronin (T3) und SB431542 (SB) ausgewählt. Diese kleinen Moleküle wurden zuvor in hiPSC-CM-Kulturen verwendet, um die Reifung von Kardiomyozyten durch Verbesserung der Sarkomerlänge, T-Tubuli und Leitungsgeschwindigkeit zu induzieren27,28. Darüber hinaus ist bekannt, dass sowohl Dex, ein Glukokortikoid, als auch SB Entzündungen unterdrücken29,30. Daher haben wir getestet, ob der Einbau eines oder einer Kombination dieser kleinen Moleküle die strukturelle Integrität der Herzscheiben verbessern würde. Für das erste Screening wurde die Dosierung jeder Verbindung basierend auf der Konzentration ausgewählt, die typischerweise in Zellkulturmodellen verwendet wird (1 μM Dex27, 100 nM T327 und 2,5 μM SB31). Nach 12 Tagen in Kultur führte die Kombination von T3 und Dex zu der besten strukturellen Integrität der Kardiomyozyten und dem geringsten fibrotischen Umbau (ergänzende Abbildungen 4 und 5). Darüber hinaus hatte die Verwendung der Hälfte oder des Doppelten dieser T3- und Dex-Konzentrationen im Vergleich zu den normalen Konzentrationen nachteilige Auswirkungen (ergänzende Abbildung 6a, b).

Nach dem ersten Screening führten wir direkte Vergleiche von vier Kulturbedingungen durch (Abb. 4a); Ctrl: Herzschnitte, kultiviert in unserer zuvor beschriebenen statischen Kultur mit unseren optimierten Kulturmedien;20,21 TD: Ctrl mit T3 und Dex zu den Kulturmedien hinzugefügt; MC: Herzschnitte, kultiviert in CTCM unter Verwendung unserer zuvor optimierten Kulturmedien; und MT: CTCM mit T3 und Dex zum Kulturmedium hinzugefügt. Nach 12 Tagen in Kultur blieb die Lebensfähigkeit von MC- und MT-Geweben ähnlich wie bei frischem Gewebe erhalten, wie durch den MTT-Assay beurteilt (Abb. 4b). Interessanterweise verbesserte die Zugabe von T3 und Dex zur Transwell-Kultur (TD) die Lebensfähigkeit im Vergleich zum Ctrl-Zustand nicht wesentlich, was auf die entscheidende Rolle der mechanischen Stimulation bei der Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Herzscheiben schließen lässt.

a Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus mit Darstellung der vier Kulturbedingungen, die zur Bewertung der Wirkung der Kombination von mechanischer Stimulation und T3/Dex-Zugabe zum Kulturmedium über einen Zeitraum von 12 Tagen verwendet wurden. b Das Balkendiagramm zeigt die Quantifizierung der Lebensfähigkeit 12 Tage nach der Kultur in allen 4 Kulturbedingungen (Strg, TD, MC und MT) im Vergleich zu frischen Herzschnitten (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Strg, D12 TD und). D12 MT), 12 (D12 MC) Scheiben/Gruppe von verschiedenen Schweinen, es wird ein einfaktorieller ANOVA-Test durchgeführt; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 im Vergleich zu D0 und **p < 0,01 im Vergleich zu D12 Strg). c Balkendiagramm zeigt die Quantifizierung des Glukoseflusses 12 Tage nach der Kultur in allen 4 Kulturbedingungen (Strg, TD, MC und MT) im Vergleich zu frischen Herzschnitten (D0) (n = 6 Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, einseitig). ANOVA-Test wird durchgeführt; ###p < 0,001 im Vergleich zu D0 und ***p < 0,001 im Vergleich zu D12 Strg). d Belastungsanalysediagramm für frisches (blau), MC-Gewebe vom 12. Tag (grün) und MT-Gewebe vom 12. Tag (rot) über die zehn regionalen Punkte des Gewebeschnitts (n = 4 Schnitte/Gruppe, einseitiger ANOVA-Test wird durchgeführt; kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen). e Vulkandiagramme, die die unterschiedlich exprimierten Gene in frischen Herzschnitten (D0) im Vergleich zu Herzschnitten zeigen, die 10–12 Tage lang unter statischen Bedingungen (Strg) oder MT-Bedingungen (MT) kultiviert wurden. f Heatmap für die sarkomeren Gene für Herzschnitte, die unter jeder Kulturbedingung kultiviert wurden. Fehlerbalken sind repräsentativ für den Mittelwert ± SD.

Eine Verlagerung der Stoffwechselabhängigkeit von der Oxidation von Fettsäuren zur Glykolyse ist ein Kennzeichen der Dedifferenzierung von Kardiomyozyten. Unreife Kardiomyozyten nutzen hauptsächlich Glukose für die ATP-Produktion und haben unterentwickelte Mitochondrien mit wenigen Cristae 5,32. Der Glukoseverwertungstest zeigte, dass die Glukoseverwertung unter MC- und MT-Bedingungen ähnlich war wie im Gewebe am Tag 0 (Abb. 4c). Allerdings zeigten Ctrl-Proben im Vergleich zu frischem Gewebe einen signifikanten Anstieg der Glukoseverwertung. Dies weist darauf hin, dass die Kombination von CTCM und T3/Dex die Lebensfähigkeit des Gewebes verbessert und den metabolischen Phänotyp der 12 Tage lang kultivierten Herzschnitte bewahrt. Darüber hinaus zeigte die Belastungsanalyse, dass die Belastungswerte unter MT- und MC-Bedingungen 12 Tage lang ähnlich wie bei frischem Herzgewebe erhalten blieben (Abb. 4d).

Um den Gesamteinfluss von CTCM und T3/Dex auf die globale Transkriptionslandschaft des Herzschnittgewebes zu analysieren, führten wir RNAseq an Herzschnitten aus allen vier verschiedenen Kulturbedingungen durch (Ergänzungsdaten 1). Interessanterweise zeigten MT-Schnitte eine hohe transkriptionelle Ähnlichkeit mit frischem Herzgewebe, wobei nur 16 von 13.642 Genen unterschiedlich exprimiert wurden. Wie wir jedoch zuvor gezeigt haben, zeigten die Ctrl-Schnitte nach 10–12 Tagen in Kultur 1229 unterschiedlich exprimierte Gene (Abb. 4e). Diese Daten wurden durch qRT-PCR von Herz- und Fibroblastengenen validiert (ergänzende Abbildung 7a – c). Interessanterweise zeigten die Ctrl-Schnitte eine Herunterregulierung der Herz- und Zellzyklusgene und eine Hochregulierung der entzündlichen Genprogramme. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Dedifferenzierung, die normalerweise nach einer Langzeitkultur auftritt, unter der MT-Bedingung vollständig abgeschwächt wurde (ergänzende Abbildung 8a, b). Eine genauere Untersuchung der sarkomerischen Gene ergab, dass nur die MT-Bedingungen die sarkomerischen (Abb. 4f) und Ionenkanäle (ergänzende Abb. 9) kodierenden Gene vor einer Herunterregulierung bewahrten, die bei Ctrl-, TD- und MC-Bedingungen beobachtet wurde. Diese Daten deuten darauf hin, dass mit der Kombination aus mechanischer und humoraler Stimulation (T3/Dex) das Transkriptom von Herzschnitten ähnlich wie bei frischen Herzschnitten 12 Tage lang in Kultur aufrechterhalten werden konnte.

Diese Transkriptionsbefunde wurden durch die Tatsache bestätigt, dass die strukturelle Integrität der Kardiomyozyten in Herzschnitten im MT-Zustand am besten 12 Tage lang erhalten blieb, wie das intakte und lokalisierte Gap-Junction-Protein Connexin 43 zeigt (Abb. 5a). Darüber hinaus war die Fibrose in Herzschnitten im MT-Zustand im Vergleich zu CT signifikant reduziert und ähnelte den frischen Herzschnitten (Abb. 5b). Diese Daten deuten darauf hin, dass die Kombination aus mechanischer Stimulation und T3/Dex-Behandlung die Herzstruktur des Herzschnitts über einen längeren Zeitraum in Kultur wirksam konservierte.

a Repräsentative Immunfluoreszenzbilder für Troponin-T (grün), Connexin 43 (rot) und DAPI (blau) für frisch isolierte Herzschnitte (D0) oder Herzschnitte, die 12 Tage lang unter allen vier Kulturbedingungen kultiviert wurden (Maßstabsbalken = 100 µm) . Quantifizierung der strukturellen Integrität des Herzgewebes durch künstliche Intelligenz (n = 7 (D0 und D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC und D12 MT) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, es wird ein Einweg-ANOVA-Test durchgeführt; #### p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und *p < 0,05 oder ****p < 0,0001 im Vergleich zu D12 Strg). b Repräsentative Bilder und Quantifizierung für mit Massons Trichrom-Färbung gefärbte Herzschnitte (Maßstabsbalken = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD und D12 MC), 9 (D12 MT) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, Es wird ein einfaktorieller ANOVA-Test durchgeführt; ####p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und ***p < 0,001 oder ****p < 0,0001 im Vergleich zu D12 Strg). Fehlerbalken sind repräsentativ für den Mittelwert ± SD.

Schließlich wurde die Fähigkeit des CTCM zur Modellierung der Herzhypertrophie durch Erhöhung der Dehnungsamplitude des Herzgewebes bewertet. Bei der CTCM wurde der Spitzendruck in der Luftkammer von 80 mmHg (normale Dehnung) auf 140 mmHg erhöht (Abb. 6a). Dies entspricht einer Zunahme der Dehnung um 32 % (Abb. 6b), was zuvor gezeigt wurde, dass es sich um die angemessene prozentuale Dehnung handelt, die erforderlich ist, damit ein Herzschnitt eine Sarkomerlänge erreicht, die der bei Hypertrophie beobachteten Länge ähnelt17,19,25. Die Dehnung und Geschwindigkeit des Herzgewebes während der Kontraktion und Entspannung blieb über die sechs Kulturtage hinweg konstant (Abb. 6c). Herzschnittgewebe aus den MT-Bedingungen wurde sechs Tage lang entweder einer normalen Dehnung (MT (Norm)) oder einer Überdehnung (MT (OS)) ausgesetzt. Bereits nach vier Tagen in der Kultur war der hypertrophe Biomarker NT-ProBNP in den Kulturmedien unter MT-Bedingungen (OS) im Vergleich zu MT-Bedingungen (Norm) signifikant erhöht (Abb. 7a). Darüber hinaus war die Zellgröße in MT (OS) (Abb. 7b) nach sechs Tagen in Kultur im Vergleich zu MT (Norm)-Herzschnitten signifikant erhöht. Darüber hinaus war die nukleare Translokation von NFATC4 in überdehnten Geweben signifikant erhöht (Abb. 7c). Diese Ergebnisse zeigen die fortschreitende Entwicklung des pathologischen Umbaus nach Überdehnung und liefern einen Machbarkeitsnachweis dafür, dass das CTCM-Gerät als Plattform zur Untersuchung dehnungsinduzierter Herzhypertrophiesignale verwendet werden kann.

a Repräsentative Spuren des Luftkammerdrucks, des Flüssigkeitskammerdrucks und der Gewebebewegungsmessungen bestätigten, dass der Luftkammerdruck den Flüssigkeitskammerdruck ändert, was eine entsprechende Gewebeschnittbewegung induziert. b Repräsentative Spuren der prozentualen Dehnung und Dehnungsrate von normal gedehnten (orange) und überdehnten (blau) Gewebeschnitten. c Balkendiagramme, die die Quantifizierung der Zykluszeit (n = 19 Scheiben/Gruppe von verschiedenen Schweinen), der Kontraktionszeit (n = 18–19 Scheiben/Gruppe von verschiedenen Schweinen) und der Relaxationszeit (n = 19 Scheiben/Gruppe von verschiedenen Schweinen) zeigen. , Gewebebewegungsamplitude (n = 14 Scheiben/Gruppe von verschiedenen Schweinen), maximale Kontraktionsgeschwindigkeit (n = 14 Scheiben/Gruppe von verschiedenen Schweinen) und maximale Entspannungsgeschwindigkeiten (n = 14 (D0), 15 (D6) Scheiben/Gruppe). von verschiedenen Schweinen), zeigten Two-tailed-Student-t-Tests keinen signifikanten Unterschied in irgendeinem der Parameter, was zeigt, dass diese Parameter über 6 Tage der Überdehnungskultur konsistent blieben. Fehlerbalken sind repräsentativ für den Mittelwert ± SD.

a Balkendiagramm-Quantifizierung der NT-ProBNP-Konzentration in Kulturmedien aus Herzschnitten, die unter normalen MT-Bedingungen (Norm) oder Überdehnung (OS) kultiviert wurden (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm und D4 MTOS) Scheiben/Gruppe von verschiedenen Schweinen, Zweiwege-ANOVA wird durchgeführt; **p < 0,01 im Vergleich zur normalen Dehnung). b Repräsentative Bilder für mit Troponin-T und WGA gefärbte Herzschnitte (links) und Zellgrößenquantifizierung (rechts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) Zellen/Gruppe aus 10 verschiedenen Schnitten verschiedener Schweine, Zwei- Tailed-Student-T-Test wird durchgeführt; ****p < 0,0001 im Vergleich zur normalen Dehnung). c Repräsentative Bilder für MTOS-Herzschnitte von Tag 0 und Tag 6, immunmarkiert für Troponin-T und NFATC4 und Quantifizierung der Translokation von NFATC4 in die Kerne von CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen , Es wird ein zweiseitiger Student-t-Test durchgeführt; *p < 0,05). Fehlerbalken sind repräsentativ für den Mittelwert ± SD.

Für die translationale Herz-Kreislauf-Forschung sind zelluläre Modelle erforderlich, die in der Lage sind, das Herzmilieu originalgetreu nachzubilden. In dieser Studie wurde ein CTCM-Gerät entwickelt und charakterisiert, das ultradünne Herzscheiben stimulieren kann. Das CTCM-System umfasst physiologisch synchronisierte elektromechanische Stimulation gekoppelt mit humoraler Anreicherung mit T3 und Dex. Durch die Einwirkung dieser Faktoren auf Schweineherzschnitte blieben die Lebensfähigkeit, die strukturelle Integrität, die Stoffwechselaktivität und die Transkriptionsexpression ähnlich wie bei frischem Herzgewebe für 12 Tage in Kultur erhalten. Darüber hinaus führt eine Überdehnung des Herzgewebes zu einer überdehnungsbedingten Herzhypertrophie. Insgesamt bestätigen diese Ergebnisse die entscheidende Rolle physiologischer Kulturbedingungen bei der Aufrechterhaltung eines normalen Herzphänotyps und bieten eine Plattform für das Arzneimittelscreening.

Mehrere Faktoren tragen zur optimalen Umgebung für die Funktion und das Überleben der Kardiomyozyten bei. Die offensichtlichsten dieser Faktoren hängen mit (1) Zell-Zell-Interaktionen, (2) elektromechanischer Stimulation, (3) humoralen Faktoren und (4) Stoffwechselsubstraten zusammen. Physiologische Zell-zu-Zell-Interaktionen erfordern das Vorhandensein komplexer dreidimensionaler Netzwerke vom Typ Multizell, die von einer extrazellulären Matrix unterstützt werden. Diese komplexe Interaktion von Zellen lässt sich in vitro durch die Co-Kultivierung einzelner Zelltypen nur schwer nachbilden, lässt sich jedoch leicht erreichen, indem man die organotypische Natur der Herzschnitte nutzt.

Mechanische Dehnung und elektrische Stimulation von Kardiomyozyten sind für die Erhaltung des Herzphänotyps von wesentlicher Bedeutung33,34,35. Während bei der Konditionierung und Reifung von hiPSC-CM in großem Umfang mechanische Stimulation eingesetzt wurde, haben einige elegante Studien kürzlich versucht, Herzschnitte in Kultur mithilfe einer einachsigen Belastung mechanisch zu stimulieren17,18,19. Diese Studien haben den positiven Einfluss der zweidimensionalen einachsigen mechanischen Belastung auf den Herzphänotyp während der Kultur gezeigt. In diesen Studien wurden Herzschnitte entweder mit isometrischen Dehnungskräften17 oder linearer auxotonischer Belastung18 belastet oder der Herzzyklus wurde mithilfe einer Kraftwandlerrückkopplung und eines Streckaktuators nachgebildet19. Bei diesen Methoden wurde das Gewebe jedoch einachsig gedehnt, ohne die Bedingungen des Kulturmediums zu optimieren, was zur Herunterregulierung mehrerer Herzgene oder zur Überexpression von Genen im Zusammenhang mit der pathologischen Dehnungsreaktion führte. Das hier beschriebene CTCM bietet eine dreidimensionale elektromechanische Stimulation, die den natürlichen Herzzyklus im Hinblick auf Zykluszeit und physiologische Dehnungen (25 % Dehnung, 40 % Systole, 60 % Diastole und 72 Schläge pro Minute) nachahmt. Während diese dreidimensionale mechanische Stimulation allein nicht ausreichte, um die Gewebeintegrität aufrechtzuerhalten, war eine Kombination aus humoraler Stimulation mit T3/Dex und mechanischer Stimulation erforderlich, um die Lebensfähigkeit, Funktionalität und Integrität des Gewebes vollständig aufrechtzuerhalten.

Humorale Faktoren spielen eine wesentliche Rolle bei der Regulierung des Herzphänotyps bei Erwachsenen. Dies wurde in hiPS-CM-Studien hervorgehoben, bei denen T3 und Dex in das Kulturmedium eingearbeitet wurden, um die Reifung der Zellen zu fördern. T3 kann den Transport von Aminosäuren, Zucker und Kalzium durch die Zellmembran beeinflussen36. Darüber hinaus fördert T3 die Expression von MHC-α und die Herunterregulierung von MHC-β, wodurch schnell kontrahierende Myofibrillen in reifen Kardiomyozyten im Vergleich zu langsam kontrahierenden Myofibrillen in fötalen CMs gefördert werden37. Der Mangel an T3 kann bei Patienten mit Schilddrüsenunterfunktion zum Verlust der myofibrillären Streifenbildung und einer verringerten Geschwindigkeit der Spannungsentwicklung führen37. Dex wirkt auf den Glukokortikoidrezeptor und erhöht nachweislich die Herzkontraktilität in ex vivo perfundierten Herzen;38 Es wird angenommen, dass eine Verbesserung mit Auswirkungen auf den speichergesteuerten Kalziumeintritt (Store-operated Calcium Entry, SOCE) zusammenhängt39,40. Darüber hinaus bindet Dex an seinen Rezeptor; Es induziert eine Vielzahl intrazellulärer Reaktionen, die die Immunfunktion und Entzündungen unterdrücken30.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass die physiologische mechanische Stimulation (MC) die Gesamtleistung der Kultur im Vergleich zur Strg-Stimulation verbesserte, die Lebensfähigkeit, die strukturelle Integrität und die Herzexpression in der Kultur jedoch nicht für 12 Tage aufrechterhalten konnte. Die Einbeziehung der T3- und Dex-Behandlung in die CTCM-Kultur (MT) führte zu einer verbesserten Lebensfähigkeit im Vergleich zu Ctrl und behielt das Transkriptionsprofil, die strukturelle Integrität und die Stoffwechselaktivität ähnlich wie bei frischem Herzgewebe für 12 Tage bei. Darüber hinaus wurde ein Modell der durch Überdehnung induzierten Herzhypertrophie mithilfe des CTCM erstellt, indem das Ausmaß der Gewebedehnung kontrolliert wurde, was die Vielseitigkeit des CTCM-Systems veranschaulicht. Es sollte beachtet werden, dass, obwohl Herzumbau und Fibrose typischerweise ein intaktes Organ mit Beiträgen von zirkulierenden Zellen betreffen, die relevante Zytokine sowie Phagozytose und andere Umbaufaktoren bereitstellen können, die Herzscheiben dennoch den fibrotischen Prozess als Reaktion auf Stress und Verletzungen nachahmen können durch Differenzierung des residenten Fibroblasten in Myofibroblasten. Dies wurde zuvor in diesem Herzschnittmodell untersucht15. Es ist zu beachten, dass die CTCM-Parameter durch Änderung der Druck-/elektrischen Amplituden und Frequenzen moduliert werden können, um viele Zustände wie Tachykardie, Bradykardie und mechanische Kreislaufunterstützung (mechanisch entlastetes Herz) zu simulieren. Dies ermöglicht, dass das System eine Plattform mit mittlerem Durchsatz für Drogentests ist. Die Fähigkeit des CTCM, durch Überdehnung verursachte Herzhypertrophie zu modellieren, eröffnet die Möglichkeit, dieses System in personalisierten Therapietests einzusetzen. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Studie, dass mechanische Dehnungen und humorale Stimulation unerlässlich sind, um Herzgewebeschnitte in Kultur zu halten.

Während die hier gezeigten Daten darauf hinweisen, dass die CTCM eine vielversprechende Plattform für die Modellierung des intakten Myokards ist, gibt es bei dieser Kulturmethode einige Einschränkungen. Die größte Einschränkung der CTCM-Kultur besteht darin, dass sie eine kontinuierliche dynamische mechanische Belastung auf die Schnitte ausübt, was die Fähigkeit ausschließt, die Herzschnittkontraktion während jedes Zyklus aktiv zu überwachen. Darüber hinaus besteht aufgrund der geringen Größe der Herzscheiben (7 mm) eine begrenzte Möglichkeit, die kontraktile Funktion außerhalb des Kultursystems mithilfe herkömmlicher Kraftaufnehmer zu beurteilen. Im aktuellen Manuskript überwinden wir diese Einschränkung teilweise durch die Beurteilung der optischen Belastung als Anzeige für die kontraktile Funktion; Diese Einschränkung bedarf jedoch weiterer Arbeit und könnte in Zukunft durch die Implementierung von Methoden zur optischen Überwachung der Funktionalität der Herzscheiben innerhalb der Kultur behoben werden, beispielsweise durch optische Kartierung mit Kalzium und spannungsempfindlichen Farbstoffen. Eine weitere Einschränkung des CTCM besteht darin, dass das Arbeitsmodell die physiologischen Drücke (Vorlast und Nachlast) nicht manipuliert. Bei der CTCM wird Druck in entgegengesetzte Richtungen induziert, um die physiologischen Dehnungen während der Diastole (Dehnung in voller Länge) und der Systole (kontrahierte Länge während der Elektrostimulation) in einem übergroßen Gewebe um 25 % zu reproduzieren. Diese Einschränkung sollte im zukünftigen CTCM-Design behoben werden, indem das Herzgewebe von beiden Seiten vollständig unter Druck gesetzt und das genaue Druck-Volumen-Verhältnis angewendet wird, das in den Herzkammern herrscht.

Der in diesem Manuskript beschriebene durch Überdehnung verursachte Umbau beschränkt sich darauf, nur hypertrophe Überdehnungssignale zu emulieren. Daher könnte dieses Modell dazu beitragen, die durch Dehnung induzierte hypertrophe Signalübertragung41,42 ohne humorale oder neuronale Faktoren (die in diesem System fehlen) zu untersuchen. Weitere Studien sind erforderlich, um dem CTCM Multiplexität zu verleihen, wie z. B. die Kokultur mit Immunzellen, zirkulierenden humoralen Plasmafaktoren und die Innervation mit der Kokultur neuronaler Zellen würden die Fähigkeit des CTCM zur Krankheitsmodellierung verbessern.

In der aktuellen Studie wurden dreizehn Schweine verwendet. Alle Tierversuche entsprachen den institutionellen Richtlinien und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Louisville genehmigt. Der Aortenbogen wurde abgeklemmt und die Herzen wurden mit 1 l steriler Kardioplegielösung (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 Einheiten/ml Heparin, pH bis 7,4) perfundiert; Die Herzen wurden in eiskalter kardioplegischer Lösung aufbewahrt, bis sie auf Eis ins Labor transportiert wurden, was normalerweise <10 Minuten dauert.

Die CTCM-Geräte wurden in der CAD-Software (Computer-Aided Design) von SolidWorks entworfen. Die Kulturkammer, die Trennplatte und die Luftkammer wurden mittels CNC-Bearbeitung (Computer Numerical Control) aus klarem Acrylkunststoff hergestellt. Die 7-mm-Stützringe wurden aus hochdichtem Polyethylen-Kunststoff (HDPE) in der Mitte gedreht und mit einer O-Ring-Nut zur Aufnahme von Silikon-O-Ringen zur Abdichtung der darunter liegenden Medien versehen. Eine dünne Silikonmembran trennt die Kulturkammer von der Trennplatte. Die Silikonmembran wurde aus einer 0,02 Zoll dicken Silikonfolie mit einer Härte von 35 A lasergeschnitten. Die unteren und oberen Silikondichtungen wurden aus einer 1/16 Zoll dicken Silikonfolie mit einer Härte von 50 A lasergeschnitten. Schrauben aus Edelstahl 316 L und Mithilfe von Flügelmuttern wurde das Gerät luftdicht zusammengehalten.

Für die Integration in das C-PACE-EM-System wurde eine kundenspezifische Leiterplatte (PCB) entwickelt. Die Ausgänge der Swiss-Machine-Header auf der Leiterplatte sind über versilberte Kupferdrähte und 0-60-Bronzeschrauben, die in die Elektroden eingeschraubt sind, mit einer Graphitelektrode verbunden. Die Platine passt in eine dreidimensional bedruckte Geräteabdeckung.

Das CTCM-Gerät wird von einem programmierbaren pneumatischen Treiber (PPD) gesteuert, der einen kontrollierten zyklischen Druck ähnlich dem Herzzyklus induzieren kann. Wenn der Druck in der Luftkammer steigt, dehnt sich die flexible Silikonmembran nach oben aus und verdrängt das Kulturmedium unter den Gewebeschnitten. Die Gewebeschnitte werden dann durch diese Flüssigkeitsverdrängung gedehnt und ahmen so die physiologische Herzdehnung während der Diastole nach. Auf dem Höhepunkt dieser Diastole wird über die Graphitelektroden eine elektrische Stimulation ausgeübt und der Luftkammerdruck verringert, wodurch sich die Gewebeschnitte zusammenziehen können. In der Luftleitung befindet sich ein hämostatisches Ventil mit einem Drucksondensensor, der den Druck des Luftsystems erkennt. Der vom Drucksensor erfasste Druck wird in ein Datenerfassungsgerät eingespeist, das an einen Laptop angeschlossen ist. Dies ermöglicht die kontinuierliche Überwachung der Drücke in der Luftkammer. Wenn der maximale Luftkammerdruck (80 mmHg für Norm und 140 mmHg für OS) erreicht ist, wird das Datenerfassungsgerät angewiesen, ein Signal an das C-PACE-EM-System zu senden, das ein zweiphasiges elektrisches Spannungssignal von 2 ms mit einer Einstellung von 4 V induziert .

Herzschnitte wurden entnommen und die Kulturbedingungen mit 6 Vertiefungen wurden wie unten beschrieben durchgeführt: Das gesammelte Herz wird aus dem Transferbehälter in eine Schale mit kalter (4 °C) Kardioplegielösung überführt. Der linke Ventrikel wird mit sterilen Klingen isoliert und in 1–2 cm3 große Blöcke geschnitten. Diese Gewebeblöcke werden mit Gewebekleber an Gewebeträgern befestigt und in das Gewebebad eines Vibrationsmikrotoms gelegt, das Tyrodes Lösung mit kontinuierlicher Sauerstoffanreicherung enthält (3 g/L 2,3-Butandionmonoxim (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g). 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-Glucose (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml einer 1 M Lösung), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml einer 1 M Lösung), bis zu 1 L ddH2O). Das Vibrationsmikrotom ist so eingestellt, dass es 300 μm dicke Scheiben mit einer Frequenz von 80 Hz, einer horizontalen Vibrationsamplitude von 2 mm und einer Vorschubgeschwindigkeit von 0,03 mm/s schneidet. Das Gewebebad ist von Eis umgeben, um eine gekühlte Lösung aufrechtzuerhalten und die Temperatur bei 4 °C zu halten. Gewebescheiben werden aus einem Mikrotombad in ein Haltebad mit kontinuierlich sauerstoffhaltiger Tyrode-Lösung auf Eis überführt, bis genügend Scheiben für eine Kulturplatte erhalten sind. Für Transwell-Kulturbedingungen werden Gewebeschnitte auf sterilisierte Polyurethan-Träger mit einer Breite von 6 mm geklebt und in Kulturplatten mit sechs Vertiefungen gegeben, die 6 ml optimiertes Kulturmedium (Medium 199, 1x ITS-Ergänzung, 10 % FBS, 5 ng/ml VEGF, 10) enthalten ng/ml FGF-basisch und 2X Antibiotikum-Antimykotikum). Die Gewebeschnitte wurden über C-Pace-Deckel elektrisch stimuliert (10 V, stimuliert mit 1,2 Hz). Für TD-Bedingungen wurden bei jedem Medienwechsel frisches T3 und Dex in Konzentrationen von 100 nM und 1 μM zugegeben. Vor jedem Medienwechsel wird das Kulturmedium dreimal täglich mit Sauerstoff angereichert. Gewebeschnitte wurden in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert.

Für die CTCM-Kultur wurden die Gewebeschnitte auf einem speziellen dreidimensional bedruckten Gerät in einer Petrischale mit modifizierter Tyrode-Lösung positioniert. Das Gerät ist so konzipiert, dass es die Herzscheibe um 25 % der Stützringfläche überdimensioniert. Dies geschieht, um sicherzustellen, dass die Herzscheibe nach der Übertragung von der Tyrode-Lösung auf Kulturmedien und während der diastolischen Phase nicht überdehnt wird. Mit Histoacrylkleber wurden die 300 μm dicken Scheiben an Stützringen mit 7 mm Durchmesser befestigt. Sobald die Gewebescheibe am Stützring befestigt war, wurde die überschüssige Gewebescheibe abgeschnitten und die befestigte Gewebescheibe wieder in das Tyrode-Lösungsbad auf Eis (4 °C) gelegt, bis genügend Scheiben für ein Gerät vorbereitet waren. Die Bearbeitungszeit sollte insgesamt für alle Geräte 2 Stunden nicht überschreiten. Nachdem 6 Gewebescheiben an ihren Stützringen befestigt waren, wurde das CTCM-Gerät zusammengebaut. Die CTCM-Kulturkammer war mit 21 ml voroxidiertem Kulturmedium vorgefüllt. Die Gewebeschnitte wurden in die Kulturkammer überführt und alle Luftblasen vorsichtig mit einer Pipette entfernt. Dann wurde der Gewebeschnitt zu einer Vertiefung geführt und vorsichtig festgedrückt. Zuletzt wurde die Elektrodenabdeckung auf das Gerät aufgesetzt und das Gerät in einen Inkubator überführt. Anschließend wurde das CTCM mit den Luftschläuchen und dem C-PACE-EM-System verbunden. Der pneumatische Treiber wurde eingeschaltet und das Luftstromventil zum CTCM-Gerät geöffnet. Das C-PACE-EM-System wurde so eingestellt, dass es 4 V bei 1,2 Hz bei einer biphasischen Stimulation von 2 ms liefert. Das Kulturmedium wurde zweimal täglich gewechselt und die Elektroden wurden einmal täglich ausgetauscht, um Graphitablagerungen an den Elektroden zu vermeiden. Bei Bedarf können die Gewebeschnitte aus ihren Kulturvertiefungen entfernt werden, um eventuell darunter eingeschlossene Luftblasen zu verdrängen. Für MT-Bedingungen wurde die T3/Dex-Behandlung bei jedem Medienwechsel frisch mit 100 nM T3 und 1 μM Dex hinzugefügt. Die CTCM-Geräte wurden in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert.

Um eine Dehnungsspur der Herzscheiben zu erhalten, wurde ein spezielles Kamerasystem entwickelt. Eine DSLR-Kamera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japan) wurde mit einem Navitar Zoom 7000 18-108 mm Makroobjektiv (Navitar, San Francisco, CA) verwendet. Nach dem Austausch des Mediums durch ein frisches Kulturmedium wurde die Bildgebung bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Kamera wurde in einem Winkel von 51° aufgestellt und Videos wurden mit 30 fps aufgenommen. Zunächst wurde eine Open-Source-Software (MUSCLEMOTION43) mit Image-J verwendet, um die Bewegung der Herzscheiben zu quantifizieren. Mit MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) wurde eine Maske erstellt, um den interessierenden Bereich der schlagenden Herzscheibe zu definieren und so jegliches Rauschen zu vermeiden. Die manuell segmentierte Maske wurde auf alle Bilder in der Bildsequenz angewendet und dann dem MUSCLEMOTION-Plugin zugeführt. MUSCLE Motion nutzt die durchschnittliche Pixelintensität innerhalb jedes Frames, um seine Bewegung relativ zu einem Referenzframe zu quantifizieren. Die Daten wurden aufgezeichnet, gefiltert und zur Quantifizierung der Zykluszeit und zur Beurteilung der Gewebedehnungen während des Herzzyklus verwendet. Die Nachbearbeitung der aufgezeichneten Videos erfolgte mit einem Nullphasen-Digitalfilter erster Ordnung. Zur Quantifizierung der Gewebedehnung (Peak-to-Peak) wurde eine Peak-Analyse durchgeführt, um die Peaks und Täler des aufgezeichneten Signals zu unterscheiden. Darüber hinaus wurde eine Trendbereinigung durchgeführt, um die Signaldrift mithilfe eines Polynoms 6. Ordnung zu beseitigen. In MATLAB wurde Softwarecode entwickelt, um die gesamte Gewebebewegung, Zykluszeit, Entspannungszeit und Kontraktionszeit zu erfassen (ergänzender Softwarecode44).

Für die Belastungsanalyse haben wir unter Verwendung derselben Videos, die für die mechanische Dehnungsbeurteilung erstellt wurden, zunächst die beiden Bilder verfolgt, die die Spitzen der Bewegungen (höchster Punkt der Bewegung (oben) und niedrigster Punkt (unten)) gemäß der MUSCLEMOTION-Software darstellen. Dann segmentierten wir die Gewebebereiche und wendeten die Form aus dem Schattierungsalgorithmus auf die segmentierten Gewebe an (ergänzende Abbildung 2a). Das segmentierte Gewebe wird dann in zehn Unterflächen unterteilt und die Dehnung für jede Oberfläche wird mithilfe der folgenden Gleichung berechnet: Dehnung = (Sup−Sdown)/Sdown wobei Sup und Sdown Abstände der Form von der Schattierung der oberen und unteren Gewebe sind bzw. (ergänzende Abbildung 2b).

Herzschnitte wurden 48 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert. Fixiertes Gewebe wurde 1 Stunde lang in 10 %iger, dann in 20 %iger Saccharose dehydriert, gefolgt von 30 %iger Saccharose über Nacht. Die Scheiben wurden dann in eine Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur (OCT-Verbindung) eingebettet und nach und nach in einem Isopentan/Trockeneisbad eingefroren. In OCT eingebettete Blöcke wurden bis zum Schneiden bei –80 ° C gelagert. Die Objektträger wurden in 8 μm dicken Schnitten hergestellt.

Um das OCT von den Herzschnitten zu entfernen, wurden die Objektträger 5 Minuten lang auf einem Heizblock auf 95 °C erhitzt. Zu jedem Objektträger wurde 1 ml PBS hinzugefügt und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Schnitte permeabilisiert, indem sie 15 Minuten lang mit 0,1 % Triton-X in PBS bei Raumtemperatur behandelt wurden. Um eine unspezifische Antikörperbindung an die Proben zu verhindern, wurde 1 ml 3 % BSA-Lösung zu den Objektträgern gegeben und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde das BSA verworfen und die Objektträger mit PBS gewaschen. Mit einem Wachsstift wurde jede Probe markiert. Die Primärantikörper (1:200-Verdünnung in 1 % BSA) (Connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) und Troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) wurden dem Abschnitt für hinzugefügt Anschließend werden die Sekundärantikörper (1:200-Verdünnung in 1 % BSA) für weitere 90 Minuten getrennt durch drei Wäschen mit PBS. Um die Zielfärbung vom Hintergrund zu unterscheiden, verwendeten wir nur einen sekundären Antikörper als Kontrolle. Schließlich wurde die DAPI-Kernfärbung hinzugefügt und die Objektträger wurden in Vectashield (Vector Laboratories) montiert und mit Nagellack versiegelt Die Immunfluoreszenzbildgebung wurde mit einem Cytation 1 High Content Imager (20-fache Linsenvergrößerung) und einem Keyence-Mikroskop mit 40-facher Linsenvergrößerung durchgeführt.

Für die WGA-Färbung wurde WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) mit 5 µg/ml in PBS verwendet und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf fixierte Schnitte aufgetragen. Die Objektträger wurden dann mit PBS gewaschen, und Sudan Black wurde zu jedem Objektträger gegeben und 30 Minuten lang inkubiert. Anschließend wurden die Objektträger mit PBS gewaschen und mit Vectashield-Eindeckmedium versetzt. Die Objektträger wurden auf einem Keyence-Mikroskop mit 40-facher Linsenvergrößerung abgebildet.

OCT wurde wie oben beschrieben aus den Proben entfernt. Nachdem das OCT entfernt worden war, wurden die Objektträger über Nacht in Bouin-Lösung getaucht. Die Objektträger wurden dann 1 Stunde lang mit destilliertem Wasser gespült und dann 10 Minuten lang in Biebrich Scarlet-Säure-Fuchsin-Lösung gelegt. Die Objektträger wurden dann mit destilliertem Wasser gewaschen und 10 Minuten lang in eine 5 %ige Phosphomolybdänsäure/5 %ige Phosphorwolframsäurelösung gelegt. Ohne Spülen wurden die Objektträger 15 Minuten lang direkt in eine Anilinblaulösung überführt. Anschließend wurden die Objektträger mit destilliertem Wasser gespült und für 2 Minuten in eine 1 %ige Essigsäurelösung gelegt. Die Objektträger wurden in 200-prozentigem Ethylalkohol getrocknet und in Xylol überführt. Die gefärbten Objektträger wurden mit einem Keyence-Mikroskop mit 10-facher Linsenvergrößerung abgebildet. Der prozentuale Anteil der Fibrosefläche wurde mit der Keyence-Analyzer-Software quantifiziert.

CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), Katalog-Nr. V13154, wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers mit einigen Modifikationen verwendet. Im Detail wurde bei der Durchführung des MTT-Assays ein chirurgischer 6-mm-Stanzer verwendet, um eine ähnliche Gewebegröße sicherzustellen. Die Gewebe wurden jeweils in eine Vertiefung von 12-Well-Platten gegeben, die MTT-Substrat gemäß dem Protokoll des Herstellers enthielten. Die Schnitte wurden 3 Stunden lang bei 37 °C inkubiert und lebensfähiges Gewebe metabolisierte das MTT-Substrat unter Bildung einer violetten Formazan-Verbindung. Die MTT-Lösung wurde durch 1 ml DMSO ersetzt und 15 Minuten bei 37 °C inkubiert, um das violette Formazan aus den Herzscheiben zu extrahieren. Die Proben wurden in DMSO auf 1:10 in einer 96-Well-Platte mit klarem Boden verdünnt und die Intensität der violetten Farbe wurde mit einem Cytation Plate Reader (BioTek) bei 570 nm gemessen. Die Messwerte wurden auf das Gewicht jeder Herzscheibe normiert.

Das Medium der Herzschnitte wurde durch ein Kulturmedium mit 1 μCi/ml [5-3H]-Glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) für den Glukoseverwertungstest ersetzt, wie zuvor beschrieben46,47. Nach 4-stündiger Inkubation wurden 100 μl Medium in ein Mikrozentrifugenröhrchen ohne Deckel gegeben, das 100 μl 0,2 N HCl enthielt. Dann wurde das Röhrchen in ein Szintillationsfläschchen mit 500 μl dH2O gegeben, um die Verdampfungsdiffusion von [3H]2O bei 37 °C für 72 Stunden zu ermöglichen. Anschließend wurden die Mikrozentrifugenröhrchen aus den Szintillationsfläschchen entfernt und 10 ml Szintillationsflüssigkeit hinzugefügt. Die Szintillationszählung wurde unter Verwendung eines Tri-Carb 2900TR-Flüssigkeitsszintillationsanalysators (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA) durchgeführt. Anschließend wurde die Glukoseverwertung unter Berücksichtigung der spezifischen Aktivität von [5-3H]-Glukose, unvollständiger Äquilibrierung und Hintergrund, Verdünnung von [5-3H]-zu unmarkierter Glukose und der Effizienz des Szintillationszählers berechnet. Die Daten wurden auf das Gewicht der Herzscheiben normiert.

Die RNA wurde aus den Herzschnitten mit dem Qiagen miRNeasy Micro Kit, Nr. 210874, nach dem Protokoll des Herstellers nach Homogenisierung des Gewebes in Trizol isoliert. Die Vorbereitung, Sequenzierung und Datenanalyse der RNAseq-Bibliothek wurde wie unten beschrieben durchgeführt:

Als Inputmaterial für die RNA-Bibliotheksvorbereitungen wurde 1 μg RNA pro Probe verwendet. Sequenzierungsbibliotheken wurden mit dem NEBNext UltraTM RNA Library Prep Kit für Illumina (NEB, USA) gemäß den Empfehlungen des Herstellers erstellt und Indexcodes hinzugefügt, um jeder Probe Sequenzen zuzuordnen. Kurz gesagt, mRNA wurde unter Verwendung von Poly-T-Oligo-gebundenen Magnetkügelchen von der Gesamt-RNA gereinigt. Die Fragmentierung wurde unter Verwendung zweiwertiger Kationen bei erhöhter Temperatur in NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) durchgeführt. Der erste cDNA-Strang wurde unter Verwendung eines zufälligen Hexamer-Primers und M-MuLV-Reverse-Transkriptase (RNase H-) synthetisiert. Anschließend wurde die cDNA-Synthese des zweiten Strangs unter Verwendung von DNA-Polymerase I und RNase H durchgeführt. Verbleibende Überhänge wurden durch Exonuklease-/Polymerase-Aktivitäten in stumpfe Enden umgewandelt. Nach der Adenylierung der 3′-Enden von DNA-Fragmenten wurden NEBNext-Adapter mit Haarnadelschleifenstruktur ligiert, um die Hybridisierung vorzubereiten. Um cDNA-Fragmente mit einer Länge von vorzugsweise 150–200 bp auszuwählen, wurden die Bibliotheksfragmente mit dem AMPure XP-System (Beckman Coulter, Beverly, USA) gereinigt. Dann wurden 3 μl USER-Enzym (NEB, USA) mit größenselektierter, adaptorligierter cDNA bei 37 °C für 15 Minuten verwendet, gefolgt von 5 Minuten bei 95 °C vor der PCR. Anschließend wurde eine PCR mit Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase, Universal PCR-Primern und Index (X) Primer durchgeführt. Zuletzt wurden die PCR-Produkte gereinigt (AMPure XP-System) und die Bibliotheksqualität auf dem Agilent Bioanalyzer 2100-System bewertet. Anschließend werden die cDNA-Bibliotheken mit dem Novaseq-Sequenzer sequenziert. Die Originalbilddatendatei von Illumina wird durch die CASAVA-Basiserkennung (Base Calling) in Rohdaten umgewandelt. Rohdaten werden in Dateien im FASTQ(fq)-Format gespeichert, die Lesesequenzen und die entsprechende Basisqualität enthalten. HISAT2 wird ausgewählt, um die gefilterten sequenzierten Lesevorgänge dem Referenzgenom Sscrofa11.1 zuzuordnen. Im Allgemeinen unterstützt HISAT2 Genome jeder Größe, einschließlich solcher mit mehr als 4 Milliarden Basen, und die meisten Parameter sind auf Standard eingestellt. Gespleißte Lesevorgänge von RNA-Seq-Daten können mit HISAT2, dem schnellsten derzeit verfügbaren System, effektiv ausgerichtet werden, mit gleicher oder besserer Genauigkeit als jede andere Methode.

Die Häufigkeit des Transkripts spiegelt direkt das Niveau der Genexpression wider. Das Ausmaß der Genexpression wird anhand der Häufigkeit der Transkripte (Anzahl der Sequenzierungen) geschätzt, die dem Genom oder Exon zugeordnet sind. Die Anzahl der Lesevorgänge ist proportional zum Genexpressionsniveau, der Genlänge und der Sequenzierungstiefe. FPKM (Fragmente pro Kilobase der Transkriptsequenz pro Millionen sequenzierter Basenpaare) wurden berechnet und die P-Werte der Differentialexpression wurden unter Verwendung des DESeq2-Pakets bestimmt. Anschließend berechneten wir die Falscherkennungsraten (FDRs) für jeden P-Wert mit der Benjamini-Hochberg-Methode 9 basierend auf der integrierten R-Funktion „p.adjust“.

Die aus Herzschnitten extrahierte RNA wurde mit der SuperScript IV Vilo Master-Mischung von Thermo (Thermo, Kat.-Nr. 11756050) in einer Konzentration von 200 ng/μl in cDNA umgewandelt. Die qRT-PCR wurde unter Verwendung einer optischen 384-Well-Reaktionsplatte mit Mikroamp-Endura-Platte von Applied Biosystems (Thermo, Kat.-Nr. 4483319) mit optischer Mikroamp-Klebefolie (Thermo, Kat.-Nr. 4311971) durchgeführt. Die Reaktionsmischung besteht aus 5 μl Taqman Fast Advanced Master Mix (Thermo, Kat.-Nr. 4444557), 0,5 μl Taqman Primer und 3,5 μl H2O pro Vertiefung. Der Standard-qPCR-Zyklus wurde durchgeführt und die CT-Werte wurden mit einem Applied Biosystems Quantstudio 5 Real-Time PCR-Instrument (384-Well-Block; Produkt-Nr. A28135) gemessen. Taqman-Primer wurden von Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA gekauft 4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Alle Proben-CT-Werte wurden auf das Housekeeping-Gen GAPDH normalisiert.

Die NT-ProBNP-Freisetzung im Kulturmedium wurde mit einem NT-ProBNP-Kit (Schweine) (Kat.-Nr. MBS2086979, MyBioSource) gemäß dem Herstellerprotokoll bewertet. Kurz gesagt, 250 μl jeder Probe und jedes Standards wurden in zweifacher Ausfertigung in jede Vertiefung gegeben. Unmittelbar nach der Zugabe der Proben wurden 50 μl Nachweisreagenz A pro Vertiefung hinzugefügt. Die Platte wurde vorsichtig geschüttelt und mit einem Plate Sealer versiegelt. Anschließend wurde die Platte 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Dann wurde die Lösung abgesaugt und die Vertiefungen viermal mit 350 μl 1X-Waschlösung gewaschen, wobei die Waschlösung jedes Mal 1–2 Minuten lang inkubiert wurde. Als nächstes wurden 100 μl Nachweisreagenz B pro Zelle hinzugefügt und mit einem Plattenversiegeler versiegelt. Die Platte wurde vorsichtig geschüttelt und 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Die Lösung wurde abgesaugt und die Vertiefungen wurden fünfmal mit 350 μl 1X Waschlösung gewaschen. In jede Vertiefung wurden 90 μl Substratlösung gegeben und die Platte versiegelt. Die Platte wurde 10–20 Minuten bei 37 °C inkubiert. Pro Vertiefung wurden 50 μl Stopplösung hinzugefügt. Die Platte wurde sofort mit einem Cytation-Plattenlesegerät (BioTek) gemessen, das auf 450 nm eingestellt war.

Es wurden Leistungsanalysen durchgeführt, um die Gruppengrößen auszuwählen, die eine Leistung von >80 % zur Erkennung einer absoluten Änderung des Parameters von 10 % mit einer Fehlerrate vom Typ I von 5 % liefern. Vor den Experimenten wurden Gewebeschnitte nach dem Zufallsprinzip ausgewählt. Alle Analysen waren hinsichtlich der Bedingungen verblindet und die Proben wurden erst dekodiert, nachdem alle Daten analysiert worden waren. Zur Durchführung aller statistischen Analysen wurde die GraphPad Prism-Software (San Diego, CA) verwendet. Für alle Statistiken wurden p-Werte bei Werten <0,05 als signifikant angesehen. Für Daten mit nur zwei Gruppenvergleichen wurden zweiseitige Student-T-Tests durchgeführt. Zur Bestimmung der Signifikanz zwischen mehreren Gruppen wurde eine einfaktorielle oder zweifaktorielle ANOVA verwendet. Die Tukey-Korrektur wurde angewendet, um bei der Durchführung von Post-hoc-Tests mehrere Vergleiche zu berücksichtigen. RNAseq-Daten wurden speziell statistisch berücksichtigt, um den FDR und den p.adjust zu berechnen, wie im Abschnitt „Methoden“ zusammengefasst.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Autoren erklären, dass alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, im Papier und seinen ergänzenden Informationsdateien verfügbar sind. Die RNAseq-Daten und die Datenpunkte für jede Abbildung finden Sie in der Excel-Datei „Supplementary Data 1“. Darüber hinaus werden die RNAseq-Rohdaten im GEO-Repository unter der Zugangsnummer GSE211110 hinterlegt.

Die Autoren erklären, dass alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, im Papier und seinen ergänzenden Informationsdateien verfügbar sind. Die ergänzende Software-Codedatei zeigt die in den Analysen verwendeten Computercodes. Der Softwarecode wurde in Zenodo44 hinterlegt: https://doi.org/10.5281/zenodo.7023518.

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Die Autoren möchten den Förderagenturen danken, die diese Arbeit ermöglicht haben: TMAM wird durch die NIH-Zuschüsse R01HL147921 und P30GM127607 sowie den Zuschuss 16SDG29950012 der American Heart Association unterstützt. Die Autoren würdigen außerdem die NIH-Zuschüsse F32HL149140 (RREA), P30GM127607 (BGH), R01HL130174 (BGH), R01HL147844 (BGH), R01ES028268 (BGH), P01HL78825 (RB, BGH), UM1HL113530 (RB) und 2U54HL120163. Wir danken außerdem dem Verteidigungsministerium der Vereinigten Staaten von Amerika für den Zuschuss W81XWH-20-1-0419 (TMAM).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Jessica M. Miller, Moustafa H. Meki.

Vom Institut für Molekulare Kardiologie, Abteilung für Medizin, University of Louisville, Louisville, USA

Jessica M. Miller, Moustafa H. Meki, Qinghui Ou, Riham RE Abouleisa, Xian-Liang Tang, Abou Bakr M. Salama, Ahmad Gebreil, Cindy Lin, Roberto Bolli und Tamer MA Mohamed

Abteilung für Bioingenieurwesen, University of Louisville, Louisville, USA

Jessica M. Miller, Moustafa H. Meki, Ahmed Elnakib, Hisham Abdeltawab, Fahmi Khalifa, Ayman S. El-Baz, Guruprasad A. Giridharan und Tamer MA Mohamed

Medizinische Fakultät, Universität Zagazig, Zagazig, Ägypten

Abu Bakr M. Salama

Envirome Institute, Diabetes and Obesity Center, Medizinische Fakultät, University of Louisville, Louisville, USA

Bradford G. Hill & Tamer MA Mohamed

AnaBios Corporation, San Diego, USA

Najah Abi-Gerges

Abteilung für Pharmakologie und Toxikologie, University of Louisville, Louisville, USA

Tamer MA Mohamed

Institut für Herz-Kreislauf-Wissenschaften, Universität Manchester, Manchester, Vereinigtes Königreich

Tamer MA Mohamed

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JMM und MHM: experimentelles Design, Sammlung und Analyse molekularer und zellulärer Daten, Verfassen von Manuskripten und endgültige Genehmigung des Manuskripts; AE: Dehnungsanalyse durchgeführt; QO: Herzschneiden, Färben und Bildgeben; XL.T., RB: Sammlung von Schweineherzen und Verfassen von Manuskripten, RREA und BGH: Stoffwechselanalyse; AS, CL und AG: Immunfärbung und Trichromfärbung und -analyse; HA, FK, NA und ASE: Analyse der künstlichen Intelligenz zur Integrität des Herzschnittgewebes; GG: Technisches Design und Überwachung des CTCM und der mechanischen Stimulation; TMAM: Konzeption und Gestaltung der Gesamtarbeit sowie Bereitstellung der Finanzierung. Alle Autoren haben zur Erstellung des Manuskripts und zur endgültigen Genehmigung des Manuskripts beigetragen.

Korrespondenz mit Tamer MA Mohamed.

TMAM hält Anteile an Tenaya Therapeutics. GG berät für NuPulseCV. NA ist der wissenschaftliche Leiter und hält Anteile an Anabios. Alle anderen Autoren erklären kein konkurrierendes Interesse.

Communications Biology dankt Aida Oliván-Viguera und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Ngan Huang und Eve Rogers. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Miller, JM, Meki, MH, Elnakib, A. et al. Biomimetisches kardiales Gewebekulturmodell (CTCM) zur Nachbildung der kardialen Physiologie und Pathophysiologie ex vivo. Commun Biol 5, 934 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03919-3

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Eingegangen: 07. Februar 2022

Angenommen: 30. August 2022

Veröffentlicht: 09. September 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03919-3

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